Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
ра 15 мин. Фиксированные клетки споласкивают водой и обезвоживают возрастающими концентрациями этилового спирта (50, 70, 90 и 100%, по 2 мин в каждой). Пластинки высушивают на воздухе и заполняют лунки заливочной средой (эпон или аралдит); полимеризацию проводят при 60 °С в течение 48 ч. Лунки с затвердев-
p. ис. 3.22. Электронная микрофотография ультратонкого среза клеток НЕр-2, выросших, фиксированных и залитых в микрочашках
(X - 9350). Г34].
шим материалом вырезают из пластинки, делают на них длинный разрез и снимают пластиковый кожух (эту последнюю операцию можно опустить). Блок затачивают, закрепляют в ‘микротоме (форма готового блока должна соответствовать держателю) и режут. Поскольку толщина образца в блоке равна обычно толщине монослоя клеток и эти клетки ориентированы в блоке одинаково, необходимо, чтобы поверхность блока была правильно установлена относительно края ножа, иначе будет получаться много пустых срезов. Опытный экспериментатор может приготовить достаточное количество хороших срезов (рис. 3.22).
3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОМЕТОДА В ФАРМАКОЛОГИИ
Многие вещества оказывают токсический или летальный эффект на клеточные культуры. К числу таких веществ относятся продукты биологического происхождения, например токсины, а также различные лекарственные соединения. Тканевые культуры использовались для исследований токсинов грамотрицательных бактерий (Сулливан, неопубликованные данные) и возбудителей дифтерии [35]. Кроме того, на тканевых культурах изучалась токсичность васкулярных жидкостей (сыворотки и плазмы) [36, 37]. Многие антитоксины тормозят этот эффект, в связи с чем их свойства могут также изучаться с помощью культивируемых клеток [38].
Помимо всего прочего, отметим, что прежде, чем перейти к исследованиям на животных, чрезвычайно важно проверить антимикробные лекарственные вещества на токсичность и специфический эффект. Для этих целей очень удобен микрометод, с помощью которого без особых затрат можно произвести массовую проверку многих соединений в отношении их действия на разные клетки. Микросистема удобна еще и тем, что в ней легко менять условия окружающей среды: температуру, содержание того или иного газа в атмосфере, давление или состав культуральной среды.
Микротехника очень удобна для тестирования противовирусных препаратов, так как одновременно можно проверять несколько препаратов против целого ряда ви-pycoiB. 4
Техника проведения упомянутых выше тестов весьма сходна с техникой, описанной для титрования вирусов и проведения реакции нейтрализации.
ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА
Техника культивирования клеток в микрочашках пока еще не нашла своего полного применения. Ниже указаны те области биологических исследований, в которых с успехом можно использовать клеточные микрокультуры. В большинстве случаев микрометод представляет собой модификацию метода выращивания клеток в пробирках или в больших по объему сосудах.
А. ИММУНОЛОГИЯ
В микрочашках можно культивировать перевиваемые линии лейкоцитов [39]. Такие культуры пригодны для изучения образования лимфобластов, для проведения генетических сравнений, продукции интерферона, установления тканевой совместимости in vitro и определения свойств антилимфоцитарной сыворотки. Многие другие иммунологические тесты выполняются в микрочашках; например, можно определить совместимость по группам крови, лейкоагглютинины и лейкоцитотоксины. При постановке опыта по принципу «шахматного» титрования можно быстро провести массовый тест на тканевую совместимость. Другим примером возможного применения техники культивирования клеток в микрочашках является определение цитолитической активности комплекса невирусный антиген — антитело и роль в ней комплемента.
Б. КЛОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК
В микрочашках с помощью петли легко получить клоны клеток. Лунки, расположенные на пластинке, засевают клетками в определенной концентрации. Последовательным разбавлением клеточной суспензии можно добиться того, что в каждой лунке будет содержаться по несколько или по одной клетке, причем все разведения можно получать во многих повторностях. Наличие в лунке *одной клетки проверяют с помощью микроскопа, после чего пластинки инкубируют. Потомство одной клетки переносят в больший сосуд и получают клоповую популяцию.
В. АВТОМАТИЗАЦИЯ
Наиболее перспективным применением системы для микротитрования является создание на ее основе автоматизации. Схематически такой процесс представлен на рис. 3.23. Выше уже упоминалось, что выпускаются приспособления, в которых добавление реагентов и разбавление осуществляются автоматически. Объединив такую систему с системой окрашивания клеток (рис. 3.15) и
Б
Г
O-fl
nnii
flMAJUUUUUUUUI
[шшшиииши]
[шшишииииии]
л
Е
ж
3
и
к
1ПЛЛПЛПЛЛЛЛПП1
ууиуууиуууиу
[ллпллпллшпп!
Ъг
(ллппплплпплпм у------------в
=ь
кг"
-а
Рис. 3.23. Схема михрокультивирования тканей для автоматизированных биологических исследований.
