Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Гибридизация одноцепочечных полинуклеотидов
Если двухцепочечная ДНК денатурирована, индивидуальные цепи полинуклеотидов расходятся (гл. 1). При низкой ионной силе (например, 0,01 М) отрицательно заряженные фосфатные группы углеводофосфатной цепи отталкиваются одна от другой. Следствием этого являются два эффекта: 1) две различные нити не могут контактировать из-за взаимного электростатического отталкивания и 2) каждая нить стремится принять максимально вытянутую и относительно жесткую конформацию, так как все части остова отталкиваются одна от другой. Значит, при низкой ионной силе основания двух нуклеотидов никогда не сблизятся настолько, чтобы образовались водородные связи. Если бы ионная сила внезапно возросла (например, до 0,5 М), заряд фосфатных групп был бы частично экранирован и нити быстро приняли бы конформацию беспорядочного клубка. Однако в отсутствие отталкивания зарядов вновь образуются водородные связи, т. е. связи между гуанином и цитозином и между адени-ном и тимином (дли ДНК) или адеиином и урацилом (для РНК). Вследствие гибкости длинных полинуклеотидных нитей возможность образования внутрицепочечных (в той же самой нити) водородных связей, если концентрация не очень высока, больше, чем межцепочечных (различные нити). При этом проявляется следующая тенденция: внутрицепочечные водородные связи, как правило, образуются между очень короткими комплементарными последовательностями оснований (рис. 18-4), вследствие того, что в одной цепи не часто можно найти длинные комплементарные последовательности. По стерическим причинам не все основания будут образовывать водородные связи, и это находит свое отражение в том факте, что D2бо ДНК не восстанавливается до первоначальной величины, характерной для нативной ДНК (рис. 18-5, А). Так как участки, скрепленные водородными связями, очень коротки, их термическая стабильность низка, и они могут быть разрушены при значительно более низких температурах, чем те, которые требуются для денатурации нативной ДНК (рис. 18-5, Б). Следовательно, ДНК с виутрицепочечными водородными связями может быть превращена в одноцепочечный беспорядочный клубок при таких температурах и в условиях такой ионной силы, когда нативная ДНК была бы устойчива, и можно ожидать, что если есть время, достаточное для того, чтобы комплементарные одиночные цепи нашли друг друга, вновь образуется нативная ДНК. Так и происходит на самом деле, и этот процесс называется ренатурацией или отжигом (рис. 18-5,В). Двухтяжевая молекула не обязательно должна состоять из двух
РИС. 18-4.
А — самоструктурированная одноцепочечная ДНК. В образовании комплементарных пар участвуют основания, находящиеся в различных участках цепи, что делает структуру очень компактной; Б — ренатурированная ДНК с одним коротким некомплементарным участком.
Температура,“С
J__1__I__I
50 60 70 80 90 100 Температура, *С
А 6 8 10
Время, ч
РИС. 18-5.
А — зависимость D26q ДНК от температуры в условиях высокой ионной силы. После достижения 100°С температуру понизили до 20°С. D2m падает, как показано до величины 1,12. Б — ДНК, которая была нагрета до 100°С и охлаждена до 20°С, нагрели снова и получили кривую зависимости D2ео от температуры; изменение D теперь происходит в более широком интервале температур. В — ДНК, которую использовали в части Б, нагревали до 88°С и охлаждали в течение указанных промежутков времени. Уменьшение D2eо указывает на образование все более совершенного дуплекса (ренатурацию).
комплементарных цепей одинаковой природы, так как одна цепь может быть ДНК, а другая — РНК, а некоторые участки (от одной пары оснований до достаточно протяженных последовательностей) могут быть и не комплементарны (рис. 18-4,Б). Процесс, при котором из неодинаковых цепей образуется двухтяжевая молекула, обычно называют гибридизацией, хотя термины «ренатурация» и «гибридизация» взаимозаменяемы. Далее следует описание методик, применяемых для обнаружения гибридизации, и одновременно приводится несколько примеров их использования.
Обнаружение гибридизации с помощью равновесного центрифугирования в растворе хлорида цезия
Эта методика теперь редко используется, но одно время она была настолько распространена, что заслуживает краткого упоминания. При приготовлении гибридов ДНК—РНК учитывали тот факт, что в случае полинуклеотидов с приблизительно 50%-ным G-C-составом плотности* ДНК и РНК в CsCl отличаются приблизительно на 0,1 г/см3 (очень большое различие). Следовательно, денатурированную и ренатурированную смеси можно было центрифугировать до достижения равновесия в растворе CsCl и обнаружить гибридизацию по появлению полосы при соответствующей плотности. Для гибридов ДНК—ДНК, содержащих ДНК из одного и того же вида организмов, обычно используют различия в плотности между ДНК, меченной ,5N, 2Н или 13С, и ДНК, содержащей только 14N, ‘Н и 12С. Если бы ДНК были из различных организмов и имели различный G-С-состав, характерные для этих ДНК плотности были бы неодинаковы и гибрид можно было бы обнаружить по появлению полосы, указывающей на ДНК с промежуточной плотностью (рис. 18-6). Отметим, что при использовании этой методики, гибридизацию ДНК проводят в растворе.
