Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ТАБЛИЦА 18-1
Степень разрыва двух- и одноцепочечных ДНК с различной молекулярной массой при обычных лабораторных операциях
Двухцепочечная ДНК Одноцепочечная ДНК
Операция М 25-10* М 106-10е М 12,5-10е М 53,0-10я
Использование
пипеток
на 1 мл Безопасно Безопасно Безопасно Безопасно
серологиче
ские пипет
ки на 0 , 1 мл » Немного раз Разрывается
Заполнение рывается
центрифуж
ных ячеек
иглами 22- » Безопасно
го номера
иглами 24- Немного раз Немного раз
го номера рывается рывается
Переливание » Безопасно Безопасно Разрывается при
разбрызгивании
Свешиваиие с » Разрывается, если
другим раст отличаются
вором плотности
Встряхивание Разрыв при Разрыв при Разрывается
возникнове возникнове
нии турбу нии турбу
лентности лентности
Барботирование Безопасно Безопасно, если
воздуха медленно
Общая тенденция
1. Чувствительность к сдвигу возрастает с молекулярной массой
2. Одноцепочечная молекула более чувствительна, чем двухцепочечная моле-
кула той же длины________________________________________________________________
Измерение величины критических напряжений сдвига можно использовать для полуколичествениых аналитических определений. Например, если известно, что молекула линейна, по напряжению сдвига, которое требуется для разрыва молекулы попо-
РИС. 18-1.
Типичная калибровочная кривая, устанавливающая связь между критической скоростью перемешивания V, вызывающей разрыв молекулы ДНК пополам, и молекулярной массой различных ДНК. Концентрация растворов ДНК составляет 20 мкг/мл в 1 М NaCl. Подобные кривые очень сильно зависят от концентрации, причем критическая скорость заметно понижается с уменьшением концентрации ДНК. Чтобы определить молекулярную массу, необходимо использовать ту же самую концентрацию ДНК и ту же систему перемешивания.
20---1--i--1__1_—1__1__Jl
900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000,
V, ой/мин
лам, можно оценить молекулярную массу. Важно, однако, понять, что действительную величину напряжения сдвига никогда не измеряют. Обычно делается следующее: берется серия молекул
ДНК с известной молекулярной массой, их растворы перемешиваются с различными скоростями и строится зависимость самой низкой скорости, которая требуется для разрыва молекулы пополам, от молекулярной массы. В результате получается стандартная калибровочная кривая, которую можно использовать для оценки М образца путем измерения для этого образца критической скорости перемешивания. На рис. 18-1 приведен пример такого опыта. Калибровочную кривую можно также получить, пропуская образец через узкие трубки и строя зависимость критической скорости потока от молекулярной массы; однако методика, в которой используется перемешивание, проще.
Если молекулярная масса известна, можно установить, линейна л* молекула, потому что в случае нелинейности молекулы возникает аномальная чувствительность к сдвигу. Например, если бы вытягивали кольцевую молекулу, имеющую молекулярную массу УИ, она бы образовывала петлю длиной, равной длине молекулы с М/2, и была бы в два раза толще. Следовательно, ее чувствительность к сдвигу составляла бы одну четвертую величины, ожидаемой для молекулы с такой молекулярной массой (рис. 18-2).
Чтобы оценить величину молекулярной массы путем изучения сдвига, необходимо поддерживать постоянную концентрацию ДНК, потому что с возрастанием концентрации значительно увеличивается устойчивость к сдвигу («самозащита»).
Большое значение для выделения специфических участков молекулы ДНК имеет также возможность приготовления поло-
Действие сдвига на кольцевую молекулу. В отличие от линейной молекулы длины L (/) кольцевая молекула той же длины (2) под действием сдвига вытягивается до почти линейной структуры длиной L/2 (3), имеющей удвоенное число цепей.
