Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
+
А' В' С' D' H' I' J' К' 1/ а /3 у 5 с О' Р' Q' R'
р ренатпурация
G Т
О м n
В С Р\/Н I J К L ^
О Р Q R
А' В' С' D' Н I' J' К' L'
i
О' Р' Q' R'
смесь
денатурированных
цепей
гетероЪуплекс
РИС. 18-7.
Схема анализа гетеродуплекса.
Две различные денатурированные цепи ДНК ренатурируют. Между комплементарными основаниями (например, АА') вновь образуются водородные сьязи. Участки ДНК, для которых не находится комплементарных участков (например, EFG, MN и afVyfie), образуют петли. Отметим, что имеется два различных типа петель. В петле типа / содержится один фрагмент одноцепочечной ДНК; она получается в случае истинной делеции. В петле типа 2 содержится два фрагмента одноцепочечной ДНК; она получается, когда в каждой цепи в одном и том же участке содержится различная последовательность.
она не связывается с ними. Если поместить промытый фильтр в буфер и нагреть его до температуры, при которой происходит денатурация гибрида ДНК—РНК, мРНК будет десорбироваться с фильтра, перейдет в буфер. Таким образом мРНК может быть выделена и очищена.
Пример 18-В. Идентификация ДНК> являющейся матрицей для мРНЬС. Если мРНК, очищенную, как описано в примере 18-Б, гибридизовать с ДНК, в которой произошло выпадение некоторых последовательностей (генетическая делеция), и затем обработать гибрид РНазой, чтобы расщепить несвязанную РНК, количество связанной РНК будет уменьшаться, если мРНК была считана частично с участка, в котором имелись делеции. Таким образом можно идентифицировать последовательности в ДНК, соответствующие мРНК.
Пример 18-Г. Физическое картирование генетических деле-ций методом электронно-микроскопического анализа. Если гибридизовать две одноцепочечные молекулы ДНК, в одной из которых имеются делеции определенных последовательностей, будет происходить обычное спаривание оснований, за исключением того, что последовательностям в нормальной ДНК, соответствующим делециям, будет не с чем образовывать водородные связи. Следовательно, в результате получится двухцепочечная структура, имеющая туже длину, что и ДНК с делениями, носодержащая в месте делеции петлю, длина которой соответствует длине
делецированной последовательности. Такие гибриды готовят в растворе, и они могут быть изучены методом электронной микроскопии. По расположению и относительной величине петли можно физически картировать делецию относительно концов нормальной ДНК (рис. 18-7). Более детально этот метод описан в гл. 3 (рис. 3-16).
Концентрирование растворов макромолекул
В процессе выделения и очистки макромолекул растворы часто становятся очень разбавленными, и возникает необходимость их концентрирования. Простая методика состоит в концентрировании растворов путем центрифугирования, но часто коэффициент седиментации (гл. 11) слишком мал и эта методика не эффективна. Имеется много других удачных методик, шесть из которых здесь описываются.
Высаливание с помощью сульфата аммония
Заряженные макромолекулы в растворе (например, макромолекулы в полярных растворителях) сольватированы и вследствие этого растворимы. Если создать высокую концентрацию электролитов, ионы настолько прочно связывают молекулы растворителя, что те не могут сольватировать находящиеся в растворе макромолекулы. Следовательно, макромолекулы «уходят» из раствора. Этот процесс, называемый высаливанием, лежит в основе удобной методики осаждения таких макромолекул, как белки.
В частности, для большинства, если не для всех белков, существует предельная концентрация сульфата аммония (высокорастворимого, очень чистого и недорогого реагента), выше которой белок выпадает в осадок*. Следовательно, к раствору белка может быть добавлен твердый (NH4)2S04, пока не произойдет осаждения. Осадок собирают путем центрифугирования и затем снова растворяют в меньшем объеме любого требуемого буфера. Этот довольно общий метод непригоден, если суммарная концентрация первоначального раствора слишком низка.
Как высаливание, так и центрифугирование основываются на удалении вещества из раствора. В основе описываемых ниже методов лежит удаление воды.
* Предельное количество сульфата аммония различно для каждого белка, так что, варьируя его, можно фракционировать смесь белков.
вакуум
РИС. 18-8.
Устройство роторного испарителя.
Образец находится во вращаемой ротором / колбе 2 на водяной бане 4, обогреваемой нагревателем 3. Вся система вакуумирована. Пары растворителя конденсируются в холодильнике 5, жидкость стекает в охлаждаемую смесью сухой лед —ацетон 6 ловушку 7 и там замерзает. Специальная перегородка (не показана) предотвращает попадание сконденсировавшейся жидкости назад, во вращающуюся колбу.
Упаривание на роторном испарителе
Согласно этой методике, раствор помещают в быстро вращающуюся колбу, из которой затем откачивают воздух (рис. 18-8). При вращении жидкость образует относительно тонкую пленку, что приводит к значительному увеличению отношения поверхности к объему упариваемой жидкости. Это резко увеличивает скорость испарения. Пары воды конденсируются на холодильнике и стекают в колбу-приемник. Благодаря вакууму система заполнена почти исключительно парами воды, что и обусловливает ин-
