Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 188

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 182 183 184 185 186 187 < 188 > 189 190 191 192 193 194 .. 218 >> Следующая

гие структурные особенности полирибонуклеотидов были довольно хорошо выяснены. Исключением явилось определение структуры маленького полинуклеотида — транспортной РНК (тРНК),
о чем идет речь в следующем примере.
Пример 17-Ж. Структура транспортной РНК, обусловленная спариванием оснований. Для изучения спаривания оснований в тРНК можно использовать растворы Н20, так как имеется два набора линий, удаленных от линий Н20. Эти линии содержат большое количество информации. Один набор состоит из сигналов гуаниновых N-1-протонов в гуанин-цитозиновых (G-С)-парах, а другой — из сигналов урациловых N-3-протонов аденип-урациловых (A-U)-nap. Поскольку интенсивность линии пропорциональна числу присутствующих протонов, площади пиков в двух наборах указывают на число водородных связей в молекуле. Кроме того, отношение площадей двух наборов линий поглощения протонов показывает отношение G-С- и A^U-nap. Чтобы получить сведения о распределении G*C- и A-U-nap в молекуле, можно воспользоваться тем фактом, что тРНК в определенных местах может быть расщеплена ферментами, давая неперекры-вающийся (дискретный) набор фрагментов, каждый из которых, очевидно, поддерживается первоначальными водородными связями. Изучая спектры фрагментов, можно определить в каждом фрагменте число G-С- и A-U-nap оснований. Следовательно, всякий раз, когда известна последовательность оснований в отдельной тРНК, возможно конструирование пространственной модели тРНК, по крайней мере с учетом только водородных связей. Один из наиболее важных выводов, который может быть сделан на основании этих исследований, состоит в том, что так называемая модель клеверного листа (рис. 17-17) правильно описывает структуру тРНК в растворе.
Введение спиновых меток
Ближайшей целью ЯМР-спектроскопии является определение расстояний либо между остатками в макромолекуле, либо между лигандом и местом связывания. Метод спиновых меток позволяет делать довольно точные измерения такого рода. Принцип, лежащий в основе метода, состоит в том, что наличие парамагнитного центра (т. е. неспаренного электрона, с которым связано очень большое флуктуирующее магнитное поле, вызванное спином неспаренного электрона) приводит к значительному уширению линий любого ядра, подвергающегося действию этого флуктуирующего поля. Уширение понижается по мере увеличения расстояния между неспаренными электронами и интересующим нас яд-
РИС. 17-18.
Сигналы протонов метилыюй группы N-ацетил-глюкозамина.
А — только НАГ; Б — НАГ плюс лизоцим; В — НАГ плюс спин-меченый (при N-3 His-15) лизоцим.
[Перепечатано с разрешения из Wien, Morrisett, McConnell, Biochemistry, U, 3707—3716 (1972). Copyright by the American Chemical Society.]
I I
249,3 Гц 238,0 Гц
ром или по мере уменьшения времени, в течение которого ядро подвергается действию парамагнитного центра. Для протонов эффект наблюдается при расстояниях в 40 А, для ядра 13С (которое еще не было серьезно изучено с помощью метода спиновых меток) расстояние гораздо больше. На практике вещество, называемое спиновой меткой (т. е. вещество, содержащее свободный радикал), вводится в систему путем взаимодействия с определенным остатком белка или с лигандом, который связывается белком. Обычно это следующие вещества: бромацетамид,
N-(ОЬ-2,2,5,5-тетраметилпирролидинил)-мальнмид и различные соединения, содержащие иминоксильную группу. С целью получения объективной информации из спектров спин-меченой системы необходимо допустить, что само по себе введение спиновой метки не влияет на конформацию макромолекулы. Обычно для проверки этого показывают, что ферментативная активность сохраняется одинаковой при изменении условий и что не меняются физические свойства. Единственное слабое место метода состоит в том, что эти критерии недостаточно надежны. Использование спиновых меток лучше всего иллюстрирует следующий пример.
Пример 17-3. Расстояние между местом связывания и аминокислотным остатком белка. Если гистидин-15 лизоцима ковалентно связан со спиновой меткой, содержащей иминоксильный азот, и к ферменту добавляется субстрат — N-ацетилглюкозамин (НАГ), резонанс метильных протонов ацетамидной группы НАГ становится шире, чем в отсутствие спиновой метки (рис. 17*18). С помощью простого уравнения по ширине линии можно рассчитать расстояние между неспаренным электроном иминоксильной группы и протонами, ответственными за резонанс. После введения поправки на собственную длину спин-меченого соединения можно вычислить истинное расстояние между протонами суб-
страта и гистидином-15. Определенные таким образом расстояния приблизительно на 85—95% согласуются с величинами, полученными по данным рентгеноструктурного анализа.
Как уже объяснялось, для получения спектра на традиционных приборах ЯМР либо оставляют неизменной частоту генератора высоких частот и изменяют напряженность магнитного поля, либо фиксируют поле и изменяют частоту. Чтобы получить хорошее отношение сигнала к шуму, необходимо много раз повторять развертку и усреднять данные. Это медленный и неэффективный метод, так как в каждую единицу времени регистрируется только узкий участок спектра. Рассмотрим эффект возбуждения коротким, но очень интенсивным радиочастотным импульсом при фиксированном поле. Так как импульс на самом деле состоит из перекрывающегося спектра частот (математическое обоснование этого, а именно концепцию преобразования Фурье, можно найти почти в любом учебнике по волновой теории), импульс может одновременно возбуждать весь диапазон резонансных частот. Этот принцип, лежащий в основе фурье-спектроскопии ЯМР, и обеспечивает значительное техническое усовершенствование. Способ возбуждения требует существенных изменений в оспаще-
Предыдущая << 1 .. 182 183 184 185 186 187 < 188 > 189 190 191 192 193 194 .. 218 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed