Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах
Если пропускать растворы с высокой ионной силой, содержащие одноцепочечную ДНК, через нитроцеллюлозные фильтры, то ДНК ими задерживается (гл. 7). Если фильтры затем высушить в вакууме, ДНК связывается настолько прочно, что ее нельзя отмыть даже при высокой температуре и низкой ионной силе. С этими связанными молекулами ДНК могут затем гибридизо-ваться комплементарные одноцепочечные ДНК. При этом тотчас возникает следующая проблема: добавленные одноцепочечные молекулы будут, конечно, связываться фильтрами независимо от того, находится ли уже на фильтрах ДНК. Чтобы избежать этого осложнения, фильтры, после того как с ними связали ДНК, можно подвергнуть различным обработкам, в результате которых уже невозможно связывание одноцепочечных полинуклеотидов. Примером такой обработки является промывание фильтра раствором сывороточного альбумина быка, который, по-видимому, насыщает места связывания ДНК. После того как фильтры приготовлены и соответствующим образом обработаны, добавляется небольшой объем раствора радиоактивной одноцепочечной ДНК
* Имеются в виду плавучие плотности.— Прим. перев.
15,15 14,15 - 14,14
15 14
Возрастпание
плотности
РИС. 18-6.
Обнаружение гибридизации путем равновесного центрифугирования в CsCl (гл. 11). Кривые представляют собой фотометрические диаграммы УФ-абсорб-ционных фотографий, показывающие распределение концентраций ДНК в центрифужной ячейке.
А— смесь денатурированной ДНК фага Т7, содержащей MN и IGN; 5 — после ренатура-ции образца, анализ которого показан в части А (отметим, что имеется пять пиков: три ренатурированной ДНК и два — нерепатурированной ДНК); В — после обработки образца, анализ которого показан в части Б, экзонуклеазой, специфичной к одноцепочечной ДНК, осталась только ренатурированная ДНК. Места расположения одиоцепочечной ДНК, содержащей l4N и 15N, указаны стрелками, помеченными, соответственно 14 и 15; места расположения двухцепочечной ДНК, содержащей 15N, и гибридной с 14>J указаны стрелками, помеченными, соответственно 14,14; 14,15 и 15,15.
или РНК и смесь инкубируется в условиях, необходимых для гибридизации, т. е. в условиях высокой ионной силы и температуры от 65 до 70°С. Комплементарная радиоактивная ДНК или РНК связывается с ДНК на фильтре (рис. 7-4). Фильтр затем промывается для удаления негибридизованного материала и высушивается. Количество гибридизованной НК определяют радиометрически.
Примеры использования гибридизации
Следующие примеры иллюстрируют использование гибридизации как в аналитических, так и в препаративных целях.
Пример 18-А. Оценка генетического родства между организмами. Под генетическим родством между двумя различными организмами подразумевается наличие у них участков ДНК, полностью или частично гомологичных, т. е. имеющих некоторые достаточно протяженные идентичные или почти идентичные последовательности оснований. Для выявления этого готовят нитро-целлюлозные фильтры, содержащие одноцепочечную ДНК организма А. Затем к ним добавляют радиоактивные фрагменты одноцепочечной ДНК с низкой молекулярной массой (такие фрагменты обычно получают путем озвучивания ДНК) из организма Б и дают возможность пройти гибридизации. Молекулярная масса фрагментов ДНК Б мала, так что большая их часть не будет связана из-за того, что только небольшой участок ДНК имеет гомологию. Доля ДНК Б, связывающейся с фильтром, является мерой содержания в ней последовательностей, которые являются общими для организмов А и Б. Наблюдаемую величину содержания последовательностей необходимо скорректировать, учитывая эффективность гибридизации. Обычно это делают, добавляя одноцепочечную ДНК А (меченную другим радиоактивным изотопом) и определяя долю связавшихся молекул. Следовательно, доля молекул ДНК Б, которые гомологичны молекулам ДНК А, есть (доля связанных молекул Б)/(доля связанных молекул А). Полноту гомологии можно оценить по термической стабильности гибридизованной ДНК, используя для этого некоторые уравнения, полученные эмпирическим путем.
Этот метод может быть также использован для измерения содержания ДНК определенного типа. Например, предположим, что бактериофаг инфицирует бактерию-хозяина в радиоактивной среде роста, так что обе вновь синтезированные ДНК — фаговая и бактериальная — несут метку. Доля метки, принадлежащей ДНК фага, может быть определена путем гибридизации смеси на фильтрах, содержащих ДНК фага. Как и в примере 18-А, здесь необходимо сделать поправку на эффективность гибридизации.
Пример 18-Б. Очистка информационной, или матричной, мРНК. Если бактериофаг инфицирует бактерию в среде роста, содержащей 3Н-уридин, синтезируются радиоактивные фаговая и бактериальная мРНК. Если выделить РНК и гибридизовать на фильтрах, содержащих одноцепочечную фаговую ДНК, с фильтрами будет связываться только фаговая мРНК. При промывании фильтров уйдет вся бактериальная мРНК, поскольку
ABCDEFGHI J К LMNQPQR
