Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Методика тритиевого обмена, в которой используется гель-проникающая хроматография на различных молекулярных ситах (рис. 8-21), состоит в следующем. К белку или нуклеиновой кислоте в растворе Н2О добавляют тритиевую воду. Через различные промежутки времени отбирают пробы и помещают их на колонку. 3Н50 сильно задерживается колонкой, в то время как белки и нуклеиновые кислоты быстро проходят через нее. Используя колонку такой длины, что белок или нуклеиновая кислота проходят через нее за 10 с, концентрацию несвязанного 3Н понижают приблизительно в 108 раз. С колонки отбирают фракции и радиоактивность каждой определяют методом сцинтилля-ционного счета; концентрацию белка или нуклеиновой кислоты определяют спектрофотометрически (гл. 14) или в некоторых случаях с помощью цветных реакций на белок. Следовательно, можно измерить число обменявшихся атомов водорода, приходящееся на единицу массы или на молекулу (если известна молекулярная масса) как функцию времени.
Методом 3Н-обмена получено несколько важных результатов. Например, установлено, что протоны, участвующие в образовании водородных связей двухцепочечной ДНК, обмениваются. Из данных по кинетике изотопного обмена и равновесному распределению изотопов и влиянию на них pH выяснено, что водородные связи в двухцепочечпой ДНК постоянно разрушаются и образуются вновь; этот процесс назвали «дыханием» и предположили-, что он лежит в основе возможного механизма таких процессов, как инициация синтеза ДНК и спаривание ДНК — ДНК при генетической рекомбинации. Второй пример — определение числа водородных связей в тРНК путем измерения доли быстро обмениваемых протонов; эти данные были использованы для подтверждения одной из предложенных структур
тРНК. Третий пример — это предпринимаемая сейчас попытка изучать кинетику перехода белка из денатурированного в нативное состояние. С этой целью определяют в нем число водородных связей как функцию времени, прошедшего с момента начала ре-натурации.
Равновесный диализ
Равновесный диализ является удобным методом изучения связывания малой молекулы с макромолекулой и удобным тестом на присутствие малой молекулы. Принцип равновесного диализа состоит в следующем. Раствор макромолекул помещается внутри диализного мешка (гл. 7), как показано на рис. 18-3. Мешок подвешивается в среде, в которой в определенной концентрации содержатся малые молекулы, способные связываться с макромолекулой. Малые молекулы, свободно проникающие через стенки мембраны, диффундируют в мешок. Если бы макромолекулы отсутствовали, концентрация малых молекул внутри и снаружи мешка стала бы одинаковой. Однако в присутствии макромолекул концентрация малых молекул внутри мешка больше из-за того, что часть их связана с макромолекулами (концентрация несвязанных малых молекул внутри мешка будет всегда равна концентрации снаружи него). Измерение внутренней и внешней
РИС. 18-3.
Равновесный диализ. Диализный мешок, в котором в начальный момент времени (7) находится раствор макромолекул (штрихованные кружки) помещают в раствор, содержащий способные диализоваться и связываться с макромолекулами малые молекулы (черные точки). В условиях равновесия (2) концентрация свободных малых молекул внутри и снаружи мешка одинакова. Так как макромолекулы связывают часть малых молекул, суммарная концентрация малых молекул внутри мешка больше, чем снаружи.
концентраций в зависимости от суммарных концентраций как малых молекул, так и макромолекул дает константу связывания k
fo [несвязанные молекулы] • [макромолекула]
[комплекс] *
где величина в скобках представляет собой концентрацию, а обозначение [несвязанные молекулы] относится к концентрации малых молекул внутри мешка. Так как [несвязанные молекулы] = = [снаружи мешка] и [комплекс] = [внутри мешка]—[несвязанные молекулы] = [внутри мешка]—[снаружи мешка], уравнение можно переписать в терминах величин, которые могут быть измерены:
^___ [молекулы снаружи] • [макромолекула]
[молекулы внутри] — [молекулы снаружи]
Для получения надежных величин k необходимо, чтобы удовлетворялись некоторые условия: 1) неспецифическое связывание лиганда и макромолекулы с самим диализным мешком должно быть небольшим и, лучше всего, поддающимся измерению; 2) связывание должно быть сильным, иначе из-за ниже описываемого эффекта возможно получение отрицательного связывания (что, конечно, не имеет смысла). Этот эффект состоит в следующем: при больших концентрациях достаточно крупных макромолекул их объем составляет относительно большую долю внутренней части диализного мешка, и, если макромолекулы не связывают лиганд, его концентрация внутри диализного мешка окажется заметно меньше внешней концентрации лиганда, так как он может свободно распределяться не во всем внутреннем объеме, а лишь в части его, не занятой макромолекулами. Следовательно, связывание должно быть всегда достаточно большим, чтобы можно было пренебречь этим отрицательным эффектом.
Хотя равновесный диализ является ценным методом определения параметров связывания, он может быть, кроме того, использован и в качестве аналитического инструмента при обнаружении белков, связывающих малые молекулы. Такой подход был использован в классических опытах Вальтера Гилберта по выделению Lac-penpeccopa Е. coli. Так как Lac-penpeccop связывает индуктор изопропилтиометилгалактозид (ИПТМГ), то после того, как клеточные экстракты были фракционированы, с помощью равновесного диализа была исследована способность различных фракций связывать ИПТМГ. Используя этот прием, с помощью различных методов разделения была выделена фракция с максимальной степенью связывания ИПТМГ, и таким образом Lac-penpeccop был выделен и очищен.
