Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 17-19.
Сигнал, полученный на фурье-спектрометре ЯМР: слева показаны^ сигналы, принимаемые вычислительной машиной, справа — спектр с частотной разверткой после обработки на вычислительной машине. Параметры, на которые нужно обратить внимание, — это частота и время спада сигнала. Частота определяет положение сигнала на частотной шкале справа, а время спада опредляет Т2, которое обратно пропорциональна ширине полосы: Л — низкая частота, медленный спад; Б — высокая частота, быстрый спад; В — смесь Л и Б. [Из книги Dwek R-, Nuclear Magnetic Resonance in Biochemistry, Clarendon Press., 1973.]
Фурье-спектроскопия ЯМР
Б
К
нии приборами, поскольку, чтобы иметь спектр, полученный сигнал (рис. 17-19), необходимо расшифровать. Это делается с помощью цифрового вычислительного устройства, работающего «на линии». Детали принимающей и обрабатывающей системы слишком сложны, чтобы их здесь описывать, но они входят в коммерчески доступные инструкции по использованию аппаратуры. Снова делаются повторные развертки и, как в обычном ЯМР-эксперименте, для улучшения отношения сигнала к шуму данные усредняются; однако преимущество метода преобразования Фурье состоит в том, что требуется приблизительно одна десятая времени для получения данного отношения сигнала к шуму, что дает десятикратное увеличение чувствительности. Это означает, что, во-первых, при концентрациях, используемых в традиционном ЯМР, обнаруживаются линии, которые обычно не видны на фоне шума, и разрешение улучшается, а, во-вторых, для получения стандартной чувствительности требуется в десять раз меньшая концентрация. Возможность использования более низких концентраций ведет к двум важным последствиям: 1) можно изучать другие ядра, такие, как 13С, естественное содержание которых и чувствительность низки (табл. 17-1), и 2) можно исследовать при разных концентрациях процессы, которые очень зависят от концентрации, такие, как ферментативные реакции или ассоциация полимеров. В будущем желательно, чтобы все ЯМР-экспе-рименты велись на приборах с фурье-преобразованисм.
Использование других ядер (не протонов)
Линию резонанса может давать ядро, имеющее спин, отличный от нуля. В связи с этим, к сожалению, исключаются обычные изотопы !2С и 160 (эмпирическое правило гласит, что / = 0, если и атомный номер, и массовое число четные). Второе требование заключается в следующем: естественное содержание изотопа и магнитный момент должны быть достаточно велики, чтобы сигнал можно было обнаружить (относительная чувствительность ядер приблизительно пропорциональна кубу отношения магнитных моментов). Кроме того, лучше, чтобы спин не был >*/2, поскольку для таких ядер линии очень уширяются в связи с явлением, называемым квадрупольной релаксацией (которая не будет обсуждаться).
Этим критериям удовлетворяют три ядра I3C, 19F и 31Р. Они представляют особый интерес, так как ввиду большой поляризуемости электронных облаков химические сдвиги этих ядер составляют 400, 400 и 600 м. д. соответственно. Так как эти сдвиги при-
мерно в 50 раз больше сдвигов протонов, разрешение также намного больше, и появляется возможность увидеть более тонкие различия в окружении.
Очень велики возможности изотопа 13С ввиду широкого диапазона химических сдвигов, большей чувствительности к структурным изменениям и простых спектров. Из-за низкого содержания он редко соседствует с другим 13С, таким обазом, редко происходит расщепление линий за счет спин-спиновых взаимодействий с 13С. С помощью 13С получают информацию об окружении атомов углерода, дополняя сведения по протонам. К тому же нет необходимости в D2O, которая может иногда оказывать влияние на структуру. Однако из-за низкого естественного содержания (1%) его очень трудно обнаруживать обычными средствами. Решению этой проблемы до некоторой степени содействовало применение фурье-спектроскопии ЯМР, но чувствительность метода все еще ниже, чем в случае протонов. Окончательное решение задачи повышения чувствительности дает развитие методов обогащения 13С, хотя наряду с очевидным преимуществом, которое дает обогащение, появляются трудности, связанные с расщеплением линий. Однако даже несмотря на остающуюся проблему низкой чувствительности, уже заметен вклад ЯМР-13С в биохимию.
Недостаток применения изотопа 19F состоит в том, что обычно он отсутствует в биологических объектах. А преимущество в том, что его можно ввести в определенные места молекулы и, следовательно, он будет играть роль внешней метки. Если число таких мест невелико, спектр состоит из небольшого количества линий. В случае белков 19F используется двумя путями: 1) вводят 19F в участок связывания белка и наблюдают резонанс 19F в зависимости от действия различных агентов — pH, температуры, лигандов и т. д.; 2) используют фторированный лиганд и наблюдают сигнал от связанного и несвязанного лиганда. Таким образом можно изучить химический обмен, определить различные параметры связывания и получить некоторые данные о структуре места связывания. Изотоп 31Р, который до настоящего времени имел лишь ограниченное применение при исследовании нуклеотидов, мембран и фосфолипидов, наверняка будет более широко использоваться в будущем.
