Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
тенсивное упаривание раствора уже при комнатной температуре. Таким путем можно удалить воду, не подвергая молекулы действию температур, которые могли бы вызвать денатурацию или диссоциацию.
Лиофилизация
В основе этой методики лежит тот факт, что при достаточно низком давлении лед интенсивно возгоняется. Раствор образца замораживают и подвергают действию высокого вакуума. Отметим, что как лиофилизация, так и упаривание на роторном испарителе могут быть использованы для концентрирования растворов, содержащих небольшие молекулы, если они нелетучие.
Диализ под давлением
В гл. 7 были описаны полупроницаемые перегородки (например, Diaflo и Pellicon), через которые проходят малые молекулы и не проходят макромолекулы. Если раствор поместить в камеру, одна из стен которой представляет собой такую мембрану, скорость прохождения малых молекул (включая воду) через мембрану возрастает с увеличением давления. Следовательно, когда камера находится под давлением, вода проталкивается через мембрану и макромолекулы концентрируются (рис. 18-9).
Обратный диализ
Если поместить раствор в диализный мешок и мешок оставить на воздухе, вода из него испарится и раствор сконцентрируется. Если мешок окружен сухим высокорастворимым полимером, который не может проходить через мембрану, вода будет стремиться «покинуть» мешок, чтобы растворить сухой полимер. Этот процесс протекает быстрее, чем сушка на воздухе. Материал, который наиболее часто используется в качестве «внешнего» полимера,— полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Разновидностью этой методики является другая методика, связанная с применением универсального концентратора Minicon, выпускаемого корпорацией Amicon. Образец помещают в камеру, схематически изображенную на рис. 18-10, Проницаемая мембрана поддерживается прокладкой абсорбента. Вода и соли проходят через мембрану в прокладку до тех пор, пока объем образца станет таким, что он будет контактировать только с непроницаемой перегородкой. Это обычно приводит к концентрированию раствора в двадцать раз.
1
РИС. 18-9.
Концентрирование макромолекул с использованием мембран Diaflo или Pcllicon. Растворитель и небольшие растворенные молекулы проходят через мембрану, а макромолекулы не проходят и, следовательно, концентрируются.
/ — мембрана; 2— раствор под давлением газа или подаваемый центробежным насосом; 3 — макромолекулы, которые не могут пройти через мембрану; 4 — выход растворителя.
Схема устройства концентратора Minicon.
Образец помещается в правое отделение 1. Жидкость проходит через мембрану 2 и поглощается абсорбентом 3, находящимся в левом отделении. Когда уровень жидкости достигает непроницаемой перегородки 4, концентрирование заканчивается.
Скорость удаления жидкости при диализе под давлением (см. выше) возрастает с увеличением отношения поверхности к объему. Если раствор содержится в полых пористых волокнах (рис. 7-10), отношение поверхности к объему становится огромным. Приспособления такого рода (известные под коммерческим названием Bio-Fiber, изготовляемые фирмой Bio-Rad) состоят из пучка полупроницаемых полых волокон, прикрепленных к входному и выходному каналам. В волокне создается давление и растворитель проходит через его стенку, а остающийся раствор макромолекул концентрируется.
РИС. 18-10.
Мембраны из полых волокон
Разделение путем распределения между растворами декстрана и полиэтиленгликоля
Водные концентрированные растворы полисахарида — декстрана и полиэтиленгликоля не смешиваются. Многие биологические полимеры, компоненты клеток и даже клетки заметно различаются по растворимости в этих двух растворах и, следовательно, могут быть разделены путем распределения между указанными растворами. Согласно стандартной методике, образец добавляют либо к раствору декстрана, либо полиэтиленгликоля, прибавляют другой раствор, встряхивают для полноты перемешивания и за-
ТАБЛИЦА 18-2
Примеры разделения и концентрирования путем распределения1
Разделяемые вещества
Нативная и денатурированная ДНК Ковалентнозамкнутая кольцевая ДНК и ДНК с разомкнутым циклом или линейная ДНК Нативные и денатурированные белки Различные белки (используются при очистке ферментов)
Белок и нуклеиновая кислота ДНК и РНК Различные полинуклеотиды Вирус и комплекс вирус—антитело Различные вирусы и фаги Различные микроорганизмы Е. coli мужского и женского пола Различные виды ChloreНа Различные полиовирусные штаммы Интактные и разрушенные хлоропласты Эритроциты различных видов животных Лимфоциты, лейкоциты и тромбоциты Споры и клетки
Инсулин-секретирующие гранулы и частицы кислой фосфатазы из 3-клеток поджелудочной же-
Распространенныс системы растворителей
Факторы, влияющие на разделение
Декстран и полиэтилен гликоль Декстран и оксипропилдекстран Декстран и метилцеллюлоза Сульфат декстрана и полиэтиленгликоль Сульфат декстрана и метилцеллюлоза
Ионная сила и pH Ионная сила
pH
Отдельные ионы Температура
