Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Параллельное измерение седиментационного равновесия растворов в Н20 и D20
При достижении равновесия распределение вещества в ячейке центрифуги описывается уравнением
Мн,о (1 - t>pHj0) = , (1)
где Мнго — молекулярная масса в воде, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, со—угловая скорость (рад/с), с — концентрация, г — расстояние от оси вращения (см). Аналогичное уравнение можно написать и для раствора в D20. Говард Шахман с сотрудниками показали, что эти два уравнения могут дать значение vy так как v практически одинаков в Н20 и D20 *. Так как Мн2о отличается от Md2o (в D20 атомы водорода амидной группы обмениваются на дейтерий), одновременный анализ равновесной седиментации в Н20 и D20 позволяет получить значение у. Этот метод имеет большие преимущества, так как требует очень малого количества вещества и v измеряется одновременно с М. При ограниченном количестве вещества этот метод служит единственно подходящим, хотя и уступает в точности методам, основанным на измерении плотности. Тем не менее вследствие ошибок, вносимых при измерениях сухой массы,
* Согласно Шахману, во сколько раз М возрастает в D20, во столько же раз v уменьшается (Edclsiein S. ]., Schachman И. К., in «Methods in Enzymo-logy», eds. L. Grossman, K. Moldave, Vol. 27, 1973, pp. 83—98).— Прим. ред.
на практике метод, вероятно, дает большую точность по сравнению с другими. Можно достигнуть значительного увеличения точности, если использовать D2180, которая в последнее время стала доступной.
Измерение коэффициента диффузии
В гл. 11 говорилось, что молекулярную массу (М) можно определить по результатам измерения коэффициента седиментации (s) и коэффициента трения ([). Прямое определение f представляет трудную задачу; к счастью, эти сложности можно обойти с помощью измерения коэффициента диффузии D.
Диффузия представляет собой перемещение молекул из области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией этих молекул при отсутствии движущей силы, т. е. в результате беспорядочного движения (рис. 12-4). Коэффициент диффузии молекулы может быть просто определен по закону Фика, который связывает число молекул dn> проходящих через площадь А за время dty с градиентом концентрации dcjdt следующим уравнением:
dt
dtj
(2)
Исходя из того, что при большем коэффициенте трения молекулы движутся медленнее, можно показать, что
kT
f ’
где k — константа Больцмана и Т — абсолютная температура.
D =
(3)
оо оооо обообс в*о%?^?Ко*°
*°»о.о 0,0 O O Q O O O ЙШШ
0-00000 0,00000
.0 0 О О о
3 0 0 0° о
°oeS°o0S0^
o”ofto”o„o%
t>V о ° о°о 0 О
пиившк
НИНИд
А Б в
РИС. 12-4.
Механика диффузии.
Черные кружки первоначально находятся на дне сосуда. Затем они диффундируют вверх До тех пор, пока не распределятся равномерно по системе. А — f=0; Б — через некоторое время; В — равновесие.
Растворитель Раствор
РИС. 12-5.
Измерение диффузии.
А — начальное распределение концентрации, когда растворитель и раствор вошли в соприкосновение; кривая зависимости с от д: показывает концентрацию раствора вдоль ячейки, dcjdx от х — градиент концентрации или шлиреновское изображение. Б — через некоторое время. 1 — зависимость с от х\ 2 — зависимость clcjdx от л*.
Теперь уравнение Сведберга [гл. И, уравнение (1)] можно записать в следующем виде:
D (1 — сгр) (4)
где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, v — парциальный удельный объем макромолекулы и р — плотность раствора. Если известны s и Д из этого уравнения можно рассчитать значение М.
Коэффициент диффузии макромолекул обычно измеряют путем создания границы между буфером и раствором макромолекул с известной концентрацией с последующим наблюдением уширения этой границы во времени. Теоретически это измерение выглядит очень простым, однако на практике оно заключает в себе потенциальную ошибку. Например, D макромолекулы настолько мал (от 10~8 до 10“5), что для получения измеряемого уширения требуется в нормальных условиях целый день. В течение всего этого времени система не должна испытывать никаких механических воздействий, а точный контроль температуры должен исключить термическую конвекцию. Кроме того, если молекула заряжена (например, имеет общий положительный заряд), наличие в растворе дополнительных ионов ОН, которые диффундируют быстрее, чем макромолекула, приводит к образованию градиента электрического потенциала, который направляет макромолекулы, несущие заряд, в область с низкой концентрацией. Отсюда следует, что измерение коэффициента диффузии следует проводить в изоэлектрической точке или вблизи нее в растворе с достаточно высокой ионной силой, чтобы нейтрализовать или устранить влияние создаваемого электрического поля. Кроме того, поскольку теория основана на допущении, что молекулы
