Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 12-6.
Типичный график для определения коэффициента диффузии.
А и Я — площадь и высота кривой dcjdx на рис. 12-5. Для небольших молекул белка шкала времени включает несколько часов, для больших вирусов она может составлять несколько дней. Обратите внимание, что прямая не проходит через начало координат. Это связано с тем, что в начальный момент граница редко бывает идеальной. Наклон графика равен Алй,
Время
должны двигаться независимо друг от друга (т. е. они не должны взаимодействовать), необходима экстраполяция до бесконечно большого разбавления.
В каждом методе, основанном на расширении границы, начальное распределение концентрации соответствует изображенному на рис. 12-5, Л, и изменения во времени измеряются, как показано на рис. 12-5, Б. Измерение облегчается при наблюдении градиента концентрации с применением шлиреновской оптики (гл. 11). Если Л и Я — площадь и высота шлиреновской кривой, то
4 *ГН = (±]\ (5)
а график зависимости (А/Н)2 от t представляет собой прямую линию с наклоном 4nD (рис. 12-6).
Начальную границу можно получить несколькими путями. В стандартной диффузионной ячейке растворитель наслаивается на раствор макромолекул. Начальная граница может быть получена в специальной ячейке аналитической центрифуги для искусственного образования границы (рис. 12-7), в которой при достижении критической скорости растворитель проходит через тонкий капилляр в раствор. В этом случае центрифуга работает на скорости, достаточно низкой для того, чтобы седиментация не оказывала заметного влияния. Такой метод полезен в случаях, когда можно получить лишь образец небольшого размера. Вариант метода центрифугирования заключается в том, что ячейку заполняют только раствором и центрифугируют; граница образуется в результате седиментации, а уширение границы измеряют в процессе седиментации, однако для анализа данных используют другое уравнение.
Существует замечательный метод — смешанная оптическая спектроскопия, который включает рассеяние светового луча лазера. Поскольку молекулы в растворе совершают поступательное движение (т. е. диффундируют), в рассеянном свете будет наблю-
РИС. 12-7.
Один из типов границеобразующей ячейки* (клапанного типа) для ультрацентрифуги фирмы Beckman.
Алюминиевый сердечник с плоскодонным гнездом на том месте, где обычно находится .отверстие для заполнения (рис. 11-3), имеет небольшое круглое отверстие с канавкой по периметру (на рисунке не показана) на дне гнезда. В это отверстие вставляется резиновая пробка. В гнездо помещается большой стакан, имеющий отверстие, в которое плотно входит пробка. Стакан содержит растворитель, а сектор сердечника — раствор. В неподвижности пробка не пропускает растворитель, однако при центрифугировании пробка сжимается и растворитель проникает из стакана через канавку в сектор (с любезного разрешения Beckman Instruments).
даться эффект Допплера, вследствие чего рассеянный свет будет обладать немного отличающейся частотой. Этот сдвиг частоты измеряют при смешении рассеянного и нерассеянного света ? последующим измерением частоты получающихся биений (т. е. разности частот). Эта разность связана с D простой зависимостью. Такой метод обеспечивает точность измерений до 1%, позволяет использовать небольшие образцы (несколько сот микрограммов), измерения проводятся быстро, причем здесь нет зависимости от ^конвекции или электрических эффектов. Недостатки метода — отсутствие серийных приборов и непригодность его для определения D молекул с очень большой длиной цепи.
В настоящее время нет удовлетворительных методов для измерения D больших несферических молекул, таких, как ДНК, поскольку в этих случаях значение D очень мало.
Список литературы
Bancroft F. СFreifelder D.t Molecular Weights of Coliphages and Coliphage DNA. 1. Measurements of the Molecular Weigths of Phage Particles by High Speed Equilibrium Centrifugation, J. Mol. Biol., 54, 537—546 (1970). Пример измерения v методом пикнометрии и путем определения азота и фосфора.
Bauer N„ Determination of Density, in “Phusical Methods of Organic Chemistry”, vol. 1, edited by A. Weissberger, Wiley, 1949, pp. 253—296. Руководство по пикнометрии.
* Для измерения коэффициента диффузии в аналитической центрифуге чаще рекомендуется употреблять другую ячейку — границеобразующую двухсекторную капиллярного типа (см. Chervenka С. ИManual of Methods for Analytical Ultracentrofuge).— Прим. ред.
Dubin S. В., Benedeck G. В., Bancroft F. С., Freifelder Z)., Molecular Weights of Coliphages and Coliphage DNA. 2. Determination of Diffusion Coefficients Using Optical Mixing Spectroscopy and Measurement of Sedimentation Coefficients, J. Mol. Biol., 54, 547—566 (1970).
Dubin S. B., Lunacek J. H., Benedeck G. B.y Observation of the Spectrum of Light Scattered by Solutions of Biological Macromolecules, Proc. Nat. Acad. Sci., 57, 1164—1171 (1967). В этой и предшествующей статьях описано использование оптической спектроскопии для определения D.
