Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Полезная информация содержится также в руководстве к ультрацентрифуге фирмы Beckman, Model Е.
Задачи
11-1. Если два стержня, жесткий и гибкий, имеют одинаковые молекулярные массы, длины и толщины, какой из них будет иметь большее значение s? Что можно сказать о сплошной и полой сферах с одинаковыми радиусами и массами?
11-2. При седиментации двух веществ с различными s в одной ячейке их границы с течением времени будут непрерывно разделяться. Напишите уравнение, описывающее это разделение в зависимости от времени.
11-3. Предположим, что диссоциирующий и вновь ассоциирующий димер наносят на градиент сахарозы и седиментируют. Опишите распределение концентрации в ячейке через различное время после начала центрифугирования. Покажите приблизительно, как будет выглядеть распределение при исключительно быстрой и медленной диссоциации, а также при средней скорости диссоциации?
11-4. Предполагается, что реагент образует межцепочечные поперечные связи между двумя полинуклеотидными цепями ДНК. Как можно это доказать методом седиментации?
11-5. Очень компактную молекулу белка обрабатывали реагентом, который привел к понижению s приблизительно на 40%. При этом получалась одна граница. Что можно сказать о действии реагента, если после обработки граница становится а) уже или б) шире?
11-6. Плотность большинства белков в CsCl составляет 1,3, хотя от этого значения могут быть отклонения в пределах 0,050 г/сма. Можно ли разделить два белка с молекулярными массами 10 000 и плотностями 1,300 и 1,340 равновесным центрифугированием в CsCl? (Скорость центрифугирования для седиментации в CsCl находится в пределах от 20 000 до 50 000 об/мин. Хотя градиент плотности зависит от скорости, для приближенного расчета его можно считать равным 0,020 г-см-3*мм“1.)
11-7. Опишите распределение концентрации в ячейке центрифуги, содержащей смесь из четырех компонентов с s —18, 26, 45 и 52, количества которых составляют 15, 25, 50 и 10% от общего количества соответственно.
11-8. Белок с молекулярной массой 50 000, дающий одну резкую седи-ментационную границу, седиментирует в 6 М хлориде гуанидиния. При этом наблюдается два шлиреновских пика, соответствующих молекулярным массам, приблизительно равным 5000 и 15 000. Площадь более медленного пика составляет две трети от площади более быстрого. Что можно сказать о субъ-единичной структуре белка?
11-9. 14N- и 15Ь1-ДНК Е. coli (50% GC) разделяют в градиенте плотности CsCl на 1,32 мм при определенной скорости и температуре. Какова будет дистанция между 14М-ДНК Е. coli и ДНК, содержащими 30 и 70% G-С при центрифугировании в этой же ячейке?
11-10. Образец ДНК дает одну зону в CsCl, но две зоны в CsCl в присутствии бромида этидия. Отношение площадей более плотной зоны к менее плотной равно 2: 1. Молекулярная масса ДНК составляет 30-106. Предположим, что ДНК обработали ферментом, который даст в среднем один одноцепочечный разрыв в каждой молекуле. Каким будет соотношение площадей после такой обработки? (Напомним, что определение доли молекул, в которых не произошло разрывов, проводится исходя из распределения Пуассона.)
11-11. Скорость седиментации сверхспирализованной ДНК изучали в зависимости от концентрации добавляемого бромида этидия. При этом было найдено, что s вначале понижается, достигает минимума, после чего вновь увеличивается. Объясните причины этого явления.
11-12. Для определения коэффициента седиментации липопротеии суспендировали в 1 М NaCl и центрифугировали. При рассмотрении шлиреновских изображений было обнаружено, что пик появляется у дна ячейки и движется по направлению к ее верху. Объясните, что происходит.
11-13. Седиментацию раствора ДНК изучали с использованием ультрафиолетовой оптической системы. Раствор ДНК разделяли на три части. К части А ничего не добавляли, а к частям Б и В прибавляли два различных реагента. Затем каждую часть центрифугировали. Для части А наблюдались типичные границы. В частях Б и В границ не было видно ни в момент достижения нужной скорости, ни спустя несколько часов. В части Б ячейка была полностью прозрачна для ультрафиолетовых лучей как выше, так и ниже мениска. В части В ячейка была практически непрозрачной. Что можно предположительно сказать о действии прибавленных реагентов на ДНК?
11-14. Если ДНК пометить 3Н-тимидином с удельной активностью 25 Ки/ммоль, каким будет сдвиг плотности в CsCl? Что будет в случае введения 14С с 1 мКи/ммоль и 32Р с 1 мКи/мкмоль?
11-15. Седиментация чистого белка в 0,25 М NaCl и Nal показала, что значения s2q,b Для этих систем различаются на 10%. Чем это можно объяснить? Каким образом предложенные возможности можно было бы различить с помощью равновесной седиментации?
11-16. Почему для получения значения s белка требуется больше, чем ДНК? (Вспомните способы регистрации границ.) Для каких типов белка это не так?
11-17. Вы проводите эксперимент по скоростной седиментации. Когда шлиреновский пик прошел половину пути, вы вспомнили, что забыли прибавить какой-то компонент к раствору. Вы остановили центрифугу, прибавили
