Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
большим для того, чтобы их можно было разделять в градиентах плотности. Однако эти цепи часто содержат пуриновые или пиримидиновые участки (т. е. последовательности оснований, содержащие только пурины или только пиримидины в отдельной цепи). Если молекула ДНК содержит преобладающее число пуриновых участков в одной цепи (и, следовательно, пиримидиновые участки в другой), прибавление полирибопиримидина приведет к связыванию его только с одной из цепей, но не с другой. Полирибонуклеотиды обладают очень большой плотностью в Cs2S04, поэтому плотность одной из цепей ДНК существенно увеличится по сравнению с другой. После разделения полирибо-нуклеотид можно легко отделить путем обработки ферментом, таким, как РНаза, или расщеплением полирибонуклеотида действием щелочи. Этот метод позволяет получить в чистом виде отдельные цепи ДНК.
Пример 11-Ф. Фракционирование двух комплементарных цепей ДНК фага К- В результате нагревания и денатурирования ДНК фага К с последующим добавлением к смеси поли-ИГ (смешанный полимер инозиновой и гуаниловой кислот) методом рав-
H2N—^ NH2 Ч)= N*/ ВГ 'с н6
\v__f U2n5
бромид ЭТИДИЯ
РИС. 11-47.
Химическая формула бромида этидия.
новесной седиментации в Cs2S04 можно разделить две комплементарные цепи, что показано на рис. 11-46.
3. Разделение ДНК, содержащих различное количество АТ, с помощью плотностной метки и седиментации в Cs2SO4. В ряде случаев требуется разделить молекулы ДНК, которые включают плотностную метку и различаются по составу оснований. Однако если для одной ДНК содержание АТ обеспечивает плотность в CsCl, равную 1,700, а для другой— 1,715, то после введения 15N и l4N их плотности составляют 1,714 и 1,715, что не позволяет их разделить. Однако в растворе Cs2S04 плотность не зависит от состава оснований (причины этого неизвестны). Следовательно, при седиментации в Cs2S04 будут обнаруживаться только различия в изотопном составе.
4. Отделение глюкозилированной ДНК от неглюкозилиро-ванной в градиенте Cs2S04. Некоторые молекулы ДНК фагов содержат глюкозилированные основания. Например, фаги Т2, Т4 и Тб Е. coli содержат 5-оксиметилцитозин вместо цитозина, причем это основание глюкозилировано. Присутствие остатков глюкозы лишь незначительно понижает плотность в CsCl (0,002 г/см3), однако в градиенте Cs2S04 это понижение значительно больше (0,020 г/см3), причем причины этого также неизвестны. Такое различие используется для контроля синтеза глюкозилированной ДНК фага в клетке хозяина, содержащей неглюкозилированную ДНК.
5. Отделение ковалентно замкнутых кольцевых молекул ДНК от линейной ДНК или ДНК> содержащей одноцепочечные разрывы, с помощью центрифугирования в CsCl в присутствии бромида этидия или иодида пропидия. Бромид этидия (рис. 11-47) способен прочно связываться с ДНК в концентрированных растворах солей, в результате чего плотность ДНК понижается приблизительно на 0,15 г/см3. Это связывание осуществляется путем вставок между парами оснований ДНК, поэтому по мере увеличения количества связываемого бромида этидия молекула ДНК все более разворачивается. Это вызвано тем, что ковалентно замкнутые кольцевые молекулы ДНК не имеют свободных кон-
цов, поэтому разворачивание вызывает скручивание всей молекулы в противоположном направлении для компенсации разворачивания. Например, при связывании достаточного количества бромида этидия для одного оборота по часовой стрелке молекула ДНК, имеющая О-образную форму, будет скручиваться против часовой стрелки, после чего приобретет форму восьмерки. Чем большее число молекул будет вставляться (интеркалиро-вать), тем больше будет скручиваться кольцевая молекула. В конце концов скручивание достигает своего предела, после чего становится невозможным и дальнейшее разворачивание. Поэтому молекулы бромида этидия не смогут больше связываться с такой ДНК. Напротив, линейные молекулы ДНК или кольцевые молекулы с одним или более одноцепочечным разрывом не имеют топологических ограничений обратному скручиванию, поэтому они способны связывать большие количества бромида этидия. Так как плотность комплекса ДНК — бромид этидия понижается с увеличением количества связанного бромида этидия, а линейные или незамкнутые кольцевые молекулы ДНК способны связать большее его количество, чем ковалентные кольцевые, при насыщающей концентрации бромида этидия последние будут иметь большую плотность. На основании этого свойства ковалентные кольцевые молекулы можно отделить от прочих седиментацией в градиенте плотности, как показано на рис. 11-48, Еще большую разность плотностей позволяет получить иодид пропидия.
Этот метод, разработанный в лаборатории Джерома Винограда, становится одним из наиболее распространенных в биохимии и молекулярной биологии как для очистки ковалентных кольцевых молекул ДНК, так и в качестве аналитического метода.
Пример 11 -X. Доказательство роли плазмид как факторов переноса резистентности. Многие штаммы Е. coli проявляют одновременную устойчивость (резистентность) к некоторым антибиотикам. Эта способность передается от резистентной клетки к чувствительной, что приводит к предположению существования в резистентных клетках плазмиды, передающей ДНК. Если из резистентных и чувствительных клеток выделить ДНК и проанализировать в CsCl в присутствии бромида этидия, то можно обнаружить, что резистентные клетки содержат небольшое количество более плотного материала, который отсутствует в чувствительных клетках. Когда же чувствительные клетки становятся резистентными, это сопровождается появлением дополнительной зоны. Таким образом, информацию об устойчивости к антибиотикам несут ковалентные кольца ДНК. Из относительного количества более плотного материала можно рассчитать минималь-
