Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
необходимое вещество, взболтали содержимое и вновь разогнали центрифугу. При этом вы замечаете, что площадь шлиреновского пика стала меньше, чем при первом центрифугировании. Является ли это результатом добавления вещества? Будет ли полученное вами значение 5 в точности соответствовать получающемуся в ячейке?
11-18. Двухцепочечную ДНК можно превратить в одноцепочечную либо нагреванием в присутствии формальдегида, либо путем доведения pH до 12,5. Обычно седиментационные диаграммы ДНК, денатурированной любым из этих методов, идентичны. Однако, если ДНК смешать с акридиновым оранжевым, а затем смесь облучить небольшой дозой света, поглощаемого акридиновым оранжевым, денатурирование этими двумя методами приведет к различным результатам. В случае нагревания с формальдегидом седиментация как облученной, так и необлученной ДНК приводит к одному и тому же — одной резкой зоне с s2o,b приблизительно на 30% большим, чем у нативной ДНК. Щелочная же обработка приводит к получению маленькой четкой Гранины и большого количества более медленно седиментирующего вещества. Объясните, чем вызваны эти различия.
11-19. Как можно экспериментально определить, будет ли определенный градиент плотности обеспечивать изокинетическую седиментацию? Будет ли градиент, изокинетический для ДНК, также изокинетическим для белка?
11-20. Можно ли ожидать, что кольцевая молекула ДНК покажет при седиментации скоростную зависимость? Объясните.
11-21. Как будет влиять прибавление бромида этидия на s20tB линейной ДНК?
11-22. При суспендировании белков в буферах, содержащих меркаптоэта-нол, происходит разрыв дисульфидных связей. Можно ли обнаружить это с помощью седиментации? Рассмотрите нативный и денатурированный белок.
11-23. Плотность ДНК в 7 М CsCl, содержащем 0,1 М MgCh, меньше, чем в одном 7 М CsCl. Объясните почему.
Парциальный удельный объем и коэффициент диффузии
В гл. 11 отмечалось, что при использовании гидродинамических методов для характеристики макромолекул часто бывает необходимо знать парциальный удельный объем и коэффициент диффузии. Методы измерения этих параметров приводятся в данной главе.
Измерение парциального удельного объема
В теории ультрацентрифугирования часто встречается величина 1 — ру, где р — плотность раствора, a v — парциальный удельный объем. Увеличение объема, вызываемое прибавлением к раствору единицы массы растворяемого вещества, равно dvldm^v. (Парциальный удельный объем иногда принимают равным обратной величине плотности растворяемого вещества, что не абсолютно точно, но часто дает хорошее совпадение.) Практика показывает, что увеличение объема раствора не соответствует объему твердого вещества; например, растворение стакана сахара в стакане воды дает раствор, объем которого значительно меньше двух стаканов (немного больше одного). Важно также помнить, что для данной макромолекулы v не является инвариантным параметром, а зависит от состава растворителя, т. е. от концентрации соли, pH, наличия или отсутствия других растворенных веществ и т. д.
Оценка значения v важна при определении молекулярной массы и коэффициента седиментации. Более того, требуется высокая точность измерения vy так как диапазон значений v для биологических макромолекул (0,6—0,75) приводит к тому, что ошибка в 1% при измерении v дает ошибку около 3% в значениях М или 5 2о,в- В действительности измерение v часто бывает лимитирующим фактором при определении молекулярной массы. Существует три основных метода определения v: суммированием мономерных остатков макромолекулы, использование методов измерения плотности и параллельные измерения седиментационного равновесия в изотопно меченных растворителях.
Суммирование V мономерных остатков макромолекулы
Если точно известен аминокислотный состав белка, то v можно рассчитать из значений v индивидуальных аминокислот как где пг — число остатков на 1 моль i-й аминокислоты в белке, rrii — молекулярная масса остатка (молекулярная масса аминокислоты минус масса 1 моля воды, поскольку при образовании пептидной связи отщепляется 1 моль воды) и Vi — парциальный удельный объем i-го остатка. Значения v остатков приводятся в справочных таблицах. Если присутствуют другие группы, такие, как липиды, углеводы, флавины и т. д., необходимо приплюсовать v такой группы. Этот метод применим для белков, однако не проверен для нуклеиновых кислот.
Методы, основанные на определении плотности
Так как v = dv/dm, значение v можно получить из изменений плотности раствора при изменении концентрации растворенного вещества. Сначала опишем четыре метода точного измерения плотности, а затем обсудим неожиданно сложную проблему точного измерения концентрации.
Пикнометрия
Пикнометр представляет собой сосуд с точно измеренным объемом, который может быть заполнен с большой точностью (рис. 12-1). Объем пикнометра обычно измеряют путем заполнения его водой и взвешивания, поскольку плотность воды хорошо известна. Затем его заполняют раствором и снова взвешивают.
РИС. 12.1. Пикнометр.
