Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Вначале взвешивают пустой пикнометр, затем его заполняют до метки и снова взвешивают. Объем до метки точно известен, / — отверстие для заполнения; 2 — метка.
РИС. 12-2.
Колонка Линдерстрема—Ланга с градиентом плотности.
Линейный градиент плотности двух органических жидкостей (обычно бромбензола и керосина, которые смешиваются друг с другом, но не смешиваются с водой) получают, используя устройство, изображенное на рис. 8-5. На колонку для калибровки градиента плотности наносят капли растворов с известной плотностью (О). Положение капель образца (ф) измеряют относительно капель сравнения.
градиент
плотности
Вследствие зависимости объема от температуры необходимо точно знать и контролировать температуру воды и раствора. Пикнометрия — самый прямой способ измерения vy однако для достижения достаточной точности требуются большие объемы раствора с высокой концентрацией (50 мг/мл); часто бывает очень трудно получить такое количество вещества. Пикнометрию обычно не применяют для очень длинных молекул, таких, как ДНК с высокой молекулярной массой, поскольку уже при концентрации
10 мг/мл раствор превращается в довольно прочный гель, что не позволяет заполнить пикнометр.
Колонка Линдерстрема — Ланга с градиентом плотности
Для этого метода сначала готовят колонку с градиентом плотности смеси бромбензол — керосин, которые не смешиваются с водой (рис. 12-2). Если на поверхность жидкости в такой колонке нанести маленькую каплю (обычно 1 мкл) водного раствора, то она будет опускаться через колонку до тех пор, пока не достигнет точки, где ее плотность будет равна плотности жидкости в колонке. Если колонку предварительно прокалибровать растворами с известными концентрациями (обычно КС1), плотность образца можно определить по его положению относительно стандартов. Для определения градиента плотности и для точного определения положения образца в колонке необходимо большее число капель стандартов и образца. Во избежание термической конвекции, которая может сказаться на движении капель, температура градиента должна контролироваться с точностью до ±0,0ГС. Большим преимуществом этого метода является возможность анали-
зировать очень малые количества материала, а также его надежность, хотя здесь и присутствуют некоторые источники ошибок, обусловленные взаимодействием с растворителями в градиенте.
Электрические весы Кана
Как и пикнометр, этот прибор позволяет точно взвешивать раствор известного объема и работать с маленькими объемами (1 мл) с относительно низкой концентрацией (~10 мг/мл). Эта возможность обусловлена высокой точностью таких весов (4=0,1 мкг), что приблизительно в 1000 раз превышает чувствительность обычных лабораторных весов. Однако высокая стоимость прибора препятствует широкому распространению.
Метод механического осциллятора
Эта методика использует коммерческий механический осциллятор, который можно заполнить жидкостью (рис. 12-3), причем его резонансная частота зависит от плотности жидкости. Такой прибор дает высокую точность при объемах образцов меньше
1 мл, поэтому он находит широкое применение.
Любой метод, основанный на измерении плотности, требует знания точного значения концентрации. На первый взгляд эта задача выглядит тривиальной, и кажется, что для этого достаточно взвесить образец и растворить его. Однако нельзя забывать, что здесь требуется масса безводного вещества, а белки и нуклеиновые кислоты, к несчастью, всегда содержат некоторое количество связанной воды. Из неорганических образцов воду можно удалить путем нагревания при высокой температуре, однако белки и нуклеиновые кислоты разлагаются при температуре
РИС. 12-3.
Механический осциллятор для измерения плотности.
Колеблющийся магнит в другом месте системы приводит в движение магнитный стер-нь, который в свою очередь передает вибрацию на V-образную трубку. Собственная И™10Та колебаний определяется формой и массой трубки. Трубку заполняют образцом.
тность которого нужно измерить, при этом изменяется собственная частота. Измеренная частота позволяет рассчитать массу прибавленной жидкости. Отсюда определяет-плотность,Лак как объем V-образной трубки точно известен, / — стальной фланец-магнитныи стержень; 3 — впускная и выпускная стеклянные полые трубки.
выше 100°С. Поэтому применяют стандартную методику, состоящую в высушивании образца белка или нуклеиновой кислоты в вакууме при температуре от 60 до 80°С до постоянной массы; при этом предполагают, что постоянная масса указывает на полное удаление воды. Тем не менее полное удаление воды из белка требует такой высокой температуры, что происходит разложение. В качестве альтернативы, сухую массу можно определять по данным элементного состава, однако такой подход использовался всего лишь несколько раз. Например, так как известны химические формулы всех аминокислот и нуклеотидов, можно рассчитать массу аминокислот и нуклеотидов по содержанию фосфора и азота, которое определяется с точностью до 1%. Следовательно, если раствор, используемый для определения плотности, проанализировать на содержание фосфора и азота, то по аминокислотному или нуклеотидному составу можно рассчитать сухую массу белка или нуклеиновой кислоты (если состав неизвестен, то его, конечно, нужно определить).
