Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
26
та и создает диффузный флюоресцирующий фон, что скрывает индивидуальные микрофиламенты и микротрубочки от наблюдения (Goldman et al., 1976; Osborn et alM 1978).
2.3.3. Резюме
Имеющиеся в наличии данные не оправдали ожиданий какой-либо корреляции туморогенности и числа или организации микрофиламентов или микротрубочек. Предположения о том, что такая корреляция существовала in vitro для клеточных линий, как доказано, необоснованны и возникли в результате наслоения экспериментальных погрешностей, включая неудачи тестирования in vivo туморогенности и, как следствие, общую ошибочную классификацию состояния клеток; использования в качестве «нормальных» контролей клеточных линий, которые (почти без сомнения) были аномальными; избытка уверенности в том, что вирусная инфекция (вероятно, следствие неадекватной методики) индуцирует предполагаемую трансформацию; использования субъективных и ошибочных качественных методик вместо количественных морфометрических; статистического анализа данных и учета общих оптических артефактов.
Отдельные цитологические характеристики сами по себе также не могут быть признаками туморогенности. Однако совокупность многих цитологических критериев может служить надежным индикатором туморогенности, по крайней мере, двух специфических клеточных систем крыс (Barker, Sanford, 1970; Montesano et al., 1977) и представляет существенный интерес в связи с вопросом, может ли данный подход иметь более общее применение.
2.4. ЗАВИСИМОСТЬ ОТ СУБСТРАТА
2.4.1. Предпосылка
Большинство клеток млекопитающих, происходящих из солидных тканей, лучше растет и более жизнеспособно в условиях прикрепления к поверхности или субстрату, чем в клеточной суспензии, свободной от таких контактов. Этот эффект назван зависимостью от субстрата (Stiker et al., 1968). Рост нормальных клеток, недавно выделенных из тканей млекопитающих в культуре, как правило, обнаруживает выраженную зависимость от субстрата. Наоборот, стационарные клеточные линии, известные как онкогенные, часто независимы от субстрата или обладают значительно сниженной зависимостью от него. Это привело к гипотезе об утрате зависимости от субстрата в культуре как показателе онкогенной трансформации (MacPherson, Montagnier, 1964; Friedman, Shin, 1974; Weinstein et al., 1975; Jones et al., 1976; Pollack, Rifkin, 1977).
В 1964 г. независимо друг от друга Burford, Sanders и MacPherson, Montagnier описали технику культивирования в геле, что дало
27
возможность оценить зависимость роста клеток в суспензии от субстрата. Метод заключается в посеве популяции клеток на неадгезивную поверхность. Перед посевом клетки находились во взвешенном состоянии либо в предварительно нагретом агаре, который становился гелем при охлаждении, либо в вязкой среде, такой, как метилцеллю-лоза. Неадгезивной поверхностью была тонкая пленка (0,5—
1 % прегелевого агара), покрывающая поверхность чашки для культивирования, что предотвращало прикрепление клеток. Агар со взвешенными в нем клетками, становясь гелем, удерживал индивидуальные клетки на месте и предотвращал прикрепление их друг к другу путем столкновения и агрегации. В этих пробах обычно используются неочищенный агар и очищенная агароза. Концентрации, используемые в суспензионном слое, едва превышают минимальные значения, необходимые для гелеобразования, и метод часто называется клонированием в мягком агаре. Вместо мягкого агара иногда использовалась метил целлюлоза, которая, будучи жидкой и достаточно вязкой, эффективно предотвращает агрегацию клеток.
Идеально, когда в пробах с гелевыми культурами все пересаженные клетки существуют первоначально как единичные изолированные клетки, не образующие адгезивный контакт с другими клетками или с субстратом. Те клетки, которые требуют для своего роста прикрепления к субстрату, теоретически не способны пролиферировать. Наоборот, клетки, не нуждающиеся в прикреплении, способны делиться и формировать прогрессивно увеличивающуюся многоклеточную колонию. Результаты такой пробы обычно выражаются в проценте клеток, способных формировать многоклеточные колонии в инокуля-те. Эта величина обозначается как колониеобразующая активность (КОА).
2*4.2. Корреляция колониеобразующей активности с туморогенностью
В поисках корреляции колониеобразующей активности и туморо-гениости мы классифицировали клетки по четырем отдельным категориям. Первая категория состоит из клеточных линий, которые могут быть туморогенными благодаря их способности формировать опухоли in vivo, вторая — из клеточных линий, выделенных из нормальных тканей, которые не формировали опухоли in vivo, никогда не подвергались воздействию потенциально трансформирующими агентами и о туморогенности которых никогда не сообщали другие лаборатории и, следовательно, которые рассматривались как нормальные. Третья категория включает клеточные линии, которые исследователи, осуществлявшие пробу на КОА, считали нетуморогенными, но которые подвергались воздействию онкогенными агентами или были выделены из злокачественной ткани. Окончательное заключение о нормальном статусе данной линии клеток не может быть сделано в связи с ограниченным числом исследований по изучению их туморогенности, а также с наличием кроме КОА других фенотипических
