Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
24
2.3.2. Цитоскелет
Изменения числа и организации микрофиламентов и микротрубочек, как утверждалось, коррелируют с онкогенной трансформацией. Многие лаборатории сообщали об уменьшении в системах клеточных культур числа видимых микрофиламентов или дезорганизации и утрате параллельных микрофиламентозных пучков или тяжей после воздействия потенциально трансформирующими агентами (McNutt et al., 1973; Dermer et al., 1974; Goldman et al., 1974; Weber et al., 1974; Pollack, Rifkin, 1975; Wickus et al., 1975; Pollack, Rifkin, 1977). Во всех цитируемых работах использовались онкогенные вирусы в качестве трансформирующих агентов и эмбриональные или ЗТЗ-клетки как мишень для трансформации. Ни в одном из этих исследований не тестировались на туморогенность клеточные линии, применяемые в опытах in vivo. Статус линий, следовательно, был неизвестным, что отвергает любые заключения о связи микрофиламентов с туморогенностью.
Более недавние исследования туморогенности in vivo, не подтвердили эти заявления. Хотя в одной работе сообщалось об уменьшении и истончении тяжей актина для некоторых спонтанно трансформированных линий грызунов (Tucker et al., 1978), другие исследователи не обнаружили корреляцию онкогенности и числа или организации микрофиламентов в системе клеточных культур (Goldman et al., 1976; Asch, 1979; Barrett et al., 1979).
Экспериментальные методы, применяемые для изучения связи микрофиламентов и туморогенности источник нескольких серьезных ошибок, включая вариацию локальной частоты микрофиламентов от одной области цитоплазмы к другой, отсутствие согласованности результатов подсчета у двух различных исследователей, наблюдавших одни и те же микрофотографии, количественные различия (вдвое) от анализа одного эксперимента к анализу следующего, стандартные колебания до 50 % среднего значения (Goldman et al., 1979; Asch et al., 1976). Эти ошибки достаточно велики, чтобы не считать действительными заключения, сделанные в большинстве опубликованных работ. Данные, полученные при изучении культур, противоречили нескольким исследованиям тканей in vivo, в которых указывалось о большем числе микрофиламентов в опухолях по сравнению с нормальными клетками (Malech, Lentz, 1974; Asch et al., 1976; Gabbiani et al., 1976; McNutt, 1976; Toh et al., 1977), хотя эти исследования могут быть подвергнуты критике по тем же соображениям, что и опыты in vitro.
Предполагалось также, что уменьшается число цитоплазматических микротрубочек и они становятся дезорганизованными вследствие онкогенной трансформации (Brinkley, 1975; Edelman, Yahara, 1976; Miller et al., 1977). Эта гипотеза основана на наблюдении в трансформированных клетках интенсивного диффузного окрашивания меченными флюоресцеином антителами к тубулину, при котором индивидуальные микротрубочки труднее распознаются. Однако в исследованиях, которые послужили основанием для этой гипотезы,
25
в действительности не определялась туморогенность in vivo использованных клеточных линий. Последующее изучение нормальных я неопластических тканей установленного статуса не подтвердило данную гипотезу. Наоборот, установлен факт утраты корреляции туморогенности с числом или организацией внутриклеточных микротрубочек (De Mey et al., 1979, Tucker et al., 1978; Asch et al.,
1978).
При изучении микротрубочек и микрофиламентов в клеточных линиях, используемых в качестве нормальных контролей, наблюдалось явное уплощение клеток с широко распластанной тонкой ламел-лоплазмой, в то время как трансформированные клетки становились округлыми или компактными с несколькими участками прикрепления ламеллярной ножки. Видимые различия организации цитоскелета нормальных и трансформированных линий, вероятно, в большинстве случаев являются результатом оптического артефакта, вызванного различной клеточной геометрией. При широкой распространенности ламеллоплазмы микрофиламенты и микротрубочки ориентированы параллельно главной оси в виде единичного тонкого слоя, который является почти двухмерным. При осмотре в флюоресцентном микроскопе после иммунофлюоресцентного окрашивания почти все фила-менты и трубочки в ламеллярной ножке выглядят в глубине поля в виде единичного фокусируемого участка и рассматриваются в продольном сечении, что делает их заметными визуально. В округлых клетках сеть цитоскелета ориентирована в трех измерениях. Индивидуальные элементы внутри этой сети распространены по всем направлениям. В результате не видно глобальной организации, хотя локальная — значительна. Больше того, многие элементы цитоскелета наблюдались на поперечном срезе скорее, чем на продольном, что затрудняло их определение, давая ложное представление о меньшем их числе, чем оно есть в действительности (Goldman et al., 1976; Osborn, Weber, 1977; Willingham et al., 1977; Tucker et al., 1978; Asch et al., 1979).
Подобный артефакт отмечается при трансмиссионной электронной микроскопии (Goldman et al., 1976; Osborn, Weber, 1977; Asch et ah, 1979). В округлые клетки, находящиеся вне фокуса, свет проникает из других частей цитоплазмы фокусируемой зоны сверху или снизу от поля зрения, сливаясь таким образом с изображением, и создает диффузную фоновую иллюминацию, которая затмевает микрофиламенты и микротрубочки при осмотре в флюоресцентном микроскопе (Edelman, Yahara, 1976; Osborn, Weber, 1977). Эта диффузная фоновая иллюминация не наблюдается в плоских клетках, так как вся цитоплазма ламеллярной ножки находится в единичном фокусе. Конечный источник артефакта при изучении флюоресцирующих препаратов — уплотнение окрашенных флюоресцеином элементов цитоскелета. Если две микротрубочки, например, лежат в пределах 55 нм одна от другой, они не могут быть обнаружены на уровне световой микроскопии и будут иметь вид единичной флюоресцирующей полосы диаметром около 200 нм (Osborn, Weber, 1977). Этот эффект уплотнения уменьшает действительное число элементов цитоскеле-
