Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
соответственно в гл. 4 и 5. В первой части данного раздела изложен общий
подход к интерпретации данных блоттинг-гибридизации по Саузерну. Затем
приведен конкретный пример анализа результатов блоттинг-гибридизации по
Саузерну для трансгенных растений моркови. Важно отметить, что все
подробности, касающиеся выделения ДНК, ее обработки рестриктазами,
электрофореза в агарозном геле, переноса по Саузерну, радиоактивного
мечения и гибридизации даны в гл. 4 и 5.
Анализ организации и экспрессии генов растений
313
В. Несколько одиночных вставок
Иcxoднaя^ 1 х Пробы 1,2,4 Проба 1 Проба 2 Исходная, 5 х
-------LB
|_В
RB
RB
RB
LB
d
Результат - три отдельные вставки в геном. Выявляются по
сегрегации Л Тандемные вставки Исходная, 1х Проба 1,2,4 Проба! Проба 2
ПробаЗ Исходная, 5 х
а RB
RB
______ LB *"-'• LB
Ь ***¦ ..
6 Т.п.н.
Результат - большой фрагмент размером 6 т.п.н. выявляется
при гибридизации с пробами, гомологичными левому и правому участкам, но
не среднему. Это позволяет предположить, что фрагмент составной.
В нем может быть пять тандемно встроенных копий Т-ДНК.
Рис. 6.3. Общая схема анализа организации Т-ДНК. RB и LB - правый и
левый повторы длиной 25 п. и.
6.2.2. Организация последовательностей чужеродной ДНК в тканях растений
Данный пример относится к генам, переносимым с помощью Ti-плазмидной
векторной системы A. tumefaciens. Впервые организация Т-ДНК в
трансформированных тканях была описана Томашовым и сотрудниками [53]. Для
того чтобы получить полную картину организации перенесенной ДНК, следует
обработать ее несколькими рестриктазами и нанести на гель для
последующего анализа по Саузерну с помощью ряда перекрывающихся проб. На
гель следует нанести исходную Т-ДНК, содержащую фрагменты Т-ДНК,
вырезанные из векторов, к которым добавлена ДНК из спермы лосося (или
другая неспеци-
314
Г лава 6
фическая ДНК), таким образом, чтобы они соответствовали определенному
содержанию Т-ДНК в геноме растения. Эти дорожки необходимы для
определения содержания обладающей той же подвижностью Т-ДНК в изучаемом
препарате и копийности полученных при рестрикции фрагментов Т-ДНК в-
геноме.
Суммируя результаты работ последних нескольких лет, образующиеся в
результате рестрикции фрагменты можно отнести по крайней мере к четырем
группам (рис. 6.3).
Внутренние фрагменты (/)
Фрагменты, присутствующие в ДНК трансформированного растения, которые
полностью гомологичны фрагментам ДНК плазмидного вектора, получаемым при
обработке той же нукле-азой. Внутренние фрагменты в геле мигрируют
аналогично соответствующим фрагментам исходной ДНК плазмидного вектора и
при одинаковой копийности дают на радиоавтографе зоны с такой же
интенсивностью.
Пограничные фрагменты (В)
Фрагменты, содержащие концы вставок перенесенной ДНК и обладающие
вследствие этого лишь частичной гомологией с рестрикционным фрагментом
векторной плазмиды. По определению пограничные фрагменты содержат ДНК.
как вектора, так и растения, а их размер зависит от расстояния ближайшего
к границе сайта узнавания используемой рестриктазы внутри перенесенной
ДНК до первого такого сайта в окружающей ее ДНК растения. Обычно
пограничные фрагменты в геле обладают иной подвижностью, чем фрагменты
исходной ДНК плазмидного вектора, обработанные той же эндонуклеазой. При
одинаковой подвижности, интенсивность полосы будет ниже, чем ожидается
для внутреннего фрагмента, поскольку пограничный фрагмент состоит не
только из последовательностей ДНК вектора.
Составные фрагменты (С)
Фрагменты, гомологичные как правому, так и левому концу Т-ДНК. Такие
фрагменты, вероятно, образуются вследствие тандемных вставок (Т),
которые, как полагают, возникают в результате предшествующей встраиванию
конкатемеризации Т-ДНК. Вместе с тем составные фрагменты могут
образоваться при встраивании отдельных фрагментов Т-ДНК очень близко друг
к другу и в одной и той же ориентации либо возникают в результате
амплификации после встраивания. Тандемные вставки чаще образуются при
использовании бинарных векторов, Перевернутые тандемные вставки также
образуют составные
Анализ организации и экспрессии генов растений
315
фрагменты, в которых отмечается гомология только с одним концом Т-ДНК.
Перестроенные фрагменты (R)
Фрагменты, возникающие, по всей видимости, вследствие перестройки Т-
ДНК в результате неправильного встраивания или при ее последующей
перестройке. Перестроенные фрагменты гомологичны как внутренним, так и
