Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
соон
Зрелый белок
Рис. 6.1. Строение и экспрессия ядерных генов растений.
СААТ и ТАТА, участвующие в связывании РНК-полимеразы
II. Для некоторых генов описаны и другие участки, расположенные до
промотора (в б'-направлении) и участвующие в регуляции экспрессии генов в
зависимой от условий окружающей среды или определенной стадии развития.
Например, недавно сообщалось [39] о включении или выключении
транскрипции, вызываемых светом или темнотой, а также о других более спе-
306
Глава 6
цифических механизмах контроля, зависимых от света (например, существуют
последовательности, изменяющие ответную реакцию фитохрома). За сайтом САР
(в З'-направлении) расположен нетранскрибируемый участок, предшествующий
кодону инициации трансляции (ATG или AUG в мРНК.), который кодирует
аминокислоту метионин. Внутри транслируемой области могут находиться один
или несколько участков, называемых нитронами, которые не обнаруживаются в
зрелой информационной РНК. Конец транслируемой области транскрипта
определяется стоп-кодоном ТАА, TAG либо TGA (соответственно UAG, UAA или
UGA в мРНК), за которым расположен нетран-слируемый участок, и затем - на
З'-конце - сигнал для поли-аденилирования, характеризующийся высоким
содержанием АТ-пар и обычно представляющий собой последовательность
G/AATAA(AA).
<5.1.2. Строение мРНК
Информационная РНК (мРНК), зрелая молекула цитоплазматической РНК,
готовая для трансляции, образуется из так называемой гетерогенной ядерной
РНК (гяРНК), которая считывается с ДНК ферментом РНК-полимеразой II (рис.
6.1). Вследствие наличия интронов и внутриядерного расщепления -
определенных последовательностей гяРНК может содержать до 75%
последовательностей, не входящих в состав зрелой мРНК. Последовательности
интронов вырезаются, и концы мРНК соединяются в строго определенных
точках, окруженных последовательностями GU с 5'-конца и AG с З'-конца. К
другим модификациям гяРНК при ее превращении в мРНК, готовой к переносу в
цитоплазму, относятся добавление кэпа, состоящего из остатка 7-
метилгуанозина, присоединенного к 5'-концу молекулы РНК 5'-5'
трифосфатной связью, а также присоединение к ее З'-концу цепочки poly
(А), в которую может входить до 250 остатков. Полагают, что кэп играет
важную роль в инициации синтеза белка. Poly (А) может способствовать
повышению устойчивости молекул РНК к деградации в цитоплазме.
6.1.3. Перенос продуктов генов в клетке
Многие белки, синтезируемые в цитоплазме, предназначены для других
областей клетки. Например, запасные белки кукурузы и ячменя (зеин и
гордеин) заключены в пузырьки эндо-плазматического ретикулума (ЭР). Малая
субъединица (МС) рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) и
хлорофилл а/Ь-связывающий белок (Cab) кодируются в ядре,
Анализ организации и экспрессии генов растений
ЗОГ
но локализованы в хлоропластах: первый в области стромы,. второй - в
гранах. Некоторые белки, например экстенсии,, секретируются в клеточную
стенку. Такие белки содержат N-концевую (5') пептидную
последовательность, которая опреде-ляет внутри- или внеклеточное
перемещение (рис. 6.1). Затем-часто в процессе переноса эта
последовательность отщепляется", и образуется зрелый белок. В случае
белков, предназначенных для переноса через мембрану, например в строму
хлоропластов, концевой пептид называют транзитным, а в случае переноса в
мембрану - сигнальным. Эти пептиды .обладают различными механизмами
действия (разд. 6.5).
6.1.4. Использование генетической трансформации для изучения экспрессии
генов растений
Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик
анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать
их организацию (блоттинг-гиб-ридизация по Саузерну), строение мРНК
(нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в
различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например,
в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-
гибридизации выделенной РНК (разд.. 6.3). Более подробные качественные
исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-
блоттин-га (приложение 6 [I]). 5'- и З'-концы транскриптов определяют,
используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют
установить только строение транскрибируемой области или гена, а также
механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых
участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени
можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции.
При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена
остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая
трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями,
уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные
вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей,
расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором
