Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 139

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 133 134 135 136 137 138 < 139 > 140 141 142 143 144 145 .. 184 >> Следующая

оказывают существенного влияния на активность ферментов.
Индикаторные гены использовались во многих работах по изучению
экспрессии генов растений, находящихся под контролем клонированных 5'-
последовательностей или нуклеотидных последовательностей, кодирующих
транзитный пептид (разд. 6.9). Такие химерные гены обладают рядом
преимуществ: продукты их трансляции часто можно использовать в
310
I'лава 6
экспериментах по трансформации в качестве как селективных" так и
индикаторных маркеров (гл. 1-3), и, располагая радиоактивным субстратом,
их можно обнаружить уже при весьма низких концентрациях. Таким образом,
результаты количественных измерений в экспериментах по изучению
последовательностей, вероятно, будут отражать контроль экспрессии гена в
А Исходные гены
ТАТА САР
Y//ZW//A
Эукариотический
ген
Последовательность Шайн-
Дальгарно
ATG
Бактериальный ген Б Слияние
генов с последующей транскрипцией и трансляцией
ТАТА CAP (S)
I ' 1-
Химерный ген
ТАТА САР АТ G
1 1
V//////A ттттжтж
Химерный ген
Y///\ Растительный промотор Транзитный пептид | | Растительные кодирующие
поспедоватепьности
[ j Бактериальный промотор
^4 Бактериальные кодирующие последовательности
Рис. 6.2. Слияние промоторных областей генов растений с индикаторными
генами бактерий.
процессе развития или при изменении условий окружающей среды. Более того,
в трансгенных растениях отпадает необходимость в разграничении экспрессии
чужеродного и хозяйского генов.
Хотя измерение ферментативной активности (например, CAT) позволяет
оценить уровень транскрипции соответствующих генов, оно не всегда в
точности соответствует последней.
Анализ организации и экспрессии генов растений
311
Например, если матрица очень стабильна, продукт накапливается в больших
количествах даже без повышения уровня транскрипции. Если изучаемый ген не
обладает ферментативной активностью, можно получить соответствующие
антитела и выявить экспрессию гена с помощью вестерн-блоттинга либо
других стандартных иммунологических методов.
Описанные выше разнообразные методики использовались для изучения
экспрессии генов в трансформированных каллусах, растениях, полученных из
них, и в Fi-поколении трансформированных растений ряда видов. В данной
главе будут рассмотрены некоторые из применяемых в настоящее время
методик, предназначенных для изучения строения и экспрессии генов.
€.2. Изучение организации Т-ДНК методом €лоттинг-гибридизации по Саузерну
<>.2.1. Общие положения
Для первоначального изучения чужеродной ДНК, встроенной в геном
растения путем трансформации с помощью агробактерий, лучше всего
использовать блоттинг-гибридизацию по Саузерну, как описано в гл. 5.
Таким образом можно получить следующие данные:
- о присутствии переносимого гена;
- о копийности трансформируемого гена, а также о том, расположены ли
множественные вставки тандемно или рассеяны по геному;
- о стабильности такой ДНК в поколении Fi трансформированных растений.
Организацию ДНК в трансформантах, полученных путем трансфекции ДНК
[метод DMGT: введение ДНК, которое стимулируется ПЭГ (разд. 3.2),
электропорация (разд. 3.3) и микроинъекции (разд. 3.4)], гораздо труднее
анализировать, поскольку в хромосомы включаются неизвестные
последовательности. В результате применения данных методов в геном
встраиваются фрагменты векторов, целые векторы либо кон-катемеры векторов
и/или самой ДНК переносимых генов. Трансформанты отбирают по доминантному
маркерному гену, а переносимый изучаемый ген обычно тесно связан с
вектором,
и, таким образом, его перенос вполне вероятен. Блоттинг-гиб-ридизация по
Саузерну в таком случае может лишь подтвердить факт переноса изучаемого
гена в трансформант. Более полное понимание организации изучаемой
чужеродной ДНК достигается лишь в результате определения
последовательности нуклеотидов.
312
Глава б
A. Ti-плазмида
| Повтор длиной 25 п.Н.
j Сайт узнавания Eco RI
Б. Одиночная вставка Исходная, 1 х Пробы 1,2,4
1-я проба, гомологичная левому участку
2-я проба, гомологичная правому участку
3,4-я пробы, гомологичные среднему участку
Проба 1
Проба 2 Исходная, 5 X

RB
RB

•••• LB
LB
Результат - одна копия вставки полной длины
Методы выделения ДНК и блоттинг-гибридизация по Сау-зерну уже описаны
Предыдущая << 1 .. 133 134 135 136 137 138 < 139 > 140 141 142 143 144 145 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed