Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
промывание), затем дважды дистиллированной Н20 (1 мин на промывание) и
дважды в 95%-ном этаноле
(1 мин на промывание).
3. Далее следуют способу А (стадии 4 и 5).
Литература
1. Bittner М., Kupferer P., Morris С. F. (1980) Electrophoretic
transfer of proteins and nucleic acids from slab gels to
diazobenzyloxymethyl cellulose or nitrocellulose sheets. Anal. Biochem.
102, 459-71. .
2. Feinberg A. P., Vogetstein B. (1984) A technique for
radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific
activity. Anal. Biochem. 137, 266-7.
3. Helling R. B., Goodman H. М.,Boyer H. W. (1974) Analysis of R.
?coRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophage and other viruses by
agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-41.
4. Khandjian E. W. (1987) Optimised hybridisation of DNA blotted and
fixed to nitrocellulose and nylon membranes. Biotechnology 5, 165-7.
5. Maniatis TFritsch E. F., Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
6. Renz М., Kurz C. (1984) A colorimetric method for DNA
hybridisation Nucl. Acids Res. 12, 3435-44.
7. Southern E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA
fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503-17.
8. Stellwag E. J., Dahlberg A. E. (1980) Electrophoretic transfer pf
DNA, RNA
and protein onto diazobenzyloxymethyl (DBM)-paper. Nucl. Acids Res.
8, 299_317,
9. Wahl G. М., Stern М., Stark G. R, (1979) Efficient transfer of
large DNA fragments from agarose gels to DBM paper and rapid
hybridisation using dextran sulphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,
3683-7.
Глава 6
Анализ организации и экспрессии генов растений
Р. Скотт, Дж. Дрейпер, Р. Джефферсон, Г. Дьюри, Л. Джэкоб
6.1. Введение
Методы генетической трансформации позволяют не только вводить новый
генетический материал в культурные растения, но также идентифицировать и
изучать последовательности нуклеотидов, контролирующие экспрессию генов.
При разработке любого проекта по генетической инженерии для получения
контролируемой экспрессии в нужных тканях на соответствующей стадии
жизненного цикла следует обращать самое серьезное внимание па манипуляции
с изучаемыми генами. Выделение генов, обладающих высоким уровнем
экспрессии в определенных органах различных растений на известной стадии
жизненного цикла, значительно облегчает идентификацию промоторов,
специфически активных в этих тканях и органах, а также позволяет
проводить фундаментальные исследования экспрессии генов в онтогенезе.
Таким образом, определены и используются в настоящее время для получения
трансгенных растений нуклеотидные последовательности, которые усиливают
или подавляют экспрессию генов в зависимости от воздействий окружающей
среды (например, света или стресса). В данной главе описываются некоторые
основные свойства генов растений, и, кроме того, изложены некоторые
подходы к изучению организаций перенесенных генов методом блоттинг-
гибридизации по Саузерну (разд. 6.2) и экспрессии генов в трансгенных
растениях.
В большинстве разделов аналитические методики разбираются на примере
определенных последовательностей нуклеотидов и белков. Однако большинство
методов можно оптимизировать для изучения ряда других генных конструкций
и продуктов определенных генов.
6.1.1. Принцип организации генов растений
Ядерные гены растений состоят из различных участков, функция которых
изучена лишь недавно (рис. 6.1). На 5'-кон-це всех генов расположена
промоторная область, которая участвует в инициации транскрипции. Внутри
этого участка в положении -70 и -30 от точки начала транскрипции (сайт
САР) расположены соответственно так называемые блоки
Анализ организации а экспрессии генов растений
305
Впереди
За (34 I -
Энхансер(ы)/
Сайленсер(ы)
Промотор
Транскрибируемая ЭнхансерЫ)/
область Сайленсер М
ДНК
Последовательность
сигнального/транзитного пептида
Транскрипция (РНК-полимераза IIJ-
v
Сигнал для полиаденилирования
Консенсус-последовательности ^ сплайсинга
agigugagu Jn
гяРНК РРР_Р
G
мРНК
^^^^^^AAUAA-N2()-GC
AUG РРР
Кэширование {гуанилтрансфераза,
мет и л азы)
7mec 2mel Оррр мр
Белок
UGA J
UAA Полиаденилирование UAG [poly-(А) -полимераза!
S ^
-^~АА(А150"200>
Сигнальный/транзитный
пептид
