Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Когда клетки растения трансформированы векторами для прямого переноса
генов посредством ДНК, сайты встраивания плазмиды, 'возможно, случайны.
Таким образом, перенесенная ДНК может представлять собой целую плазмиду
или ее части, которые соединены вместе в виде конкатемеров или
встраиваются независимо друг от друга в разные сайты генома. В таком
случае следует вначале убедиться в наличии интактных рестрикционных
фрагментов, которые содержат изучаемый ген целиком. Дальнейшее
исследование может вызвать затруднения. Есть данные, что в некоторых
опытах использование линеаризованных векторов для переноса генов
посредством ДНК приводит к повышению частоты трансформации. По-видимому,
при этом легче образуются конкатемерные структуры, рекомбинация проходит
по сайтам, не нарушающим экспрессию большинства копий изучаемого гена
(рис. 6.3,Г). В этом случае предсказанные составные фрагменты могут быть
выявлены методом блоттинг-гибридизации по Саузерну.
Любые данные по организации Т-ДНК проще интерпретировать после
изучения наследования отдельных гибридизую-щихся фрагментов при
разнообразных скрещиваниях. Если определенные полосы окажутся в одной
группе сцепления, то весьма вероятно, что они представляют собой часть
одной и той же вставки Т-ДНК- Следует отметить, что перенесенная ДНК не
всегда экспрессируется; иногда это обусловлено метилированием [22]. Таким
образом, при использовании для трансформации новых генов или новых видов
растений в первую очередь следует изучить наследуемость определенных
областей.
6.2.3. Изучение организации Т-ДНК в трансгенных растениях моркови методом
блоттинг-гибридизации
Принцип метода будет рассмотрен на примере организации химерной Т-ДНК
в трансформированных растениях моркови. Эта Т-ДНК состоит из гена
устойчивости к канамицину (nos-•npt-II), встроенного методами
генетической инженерии между границами разоруженного вектора pGV3850 на
основе агробактерий (разд. 1.1.7.1), сконструированного Замбрыски и со-
318
Глава 6
трудниками [57]. Рестрикционные карты плазмид pGV3850 и pGV3850:: 1103
приведены на рис. 6.4. Перенос этой ДНК в клетки моркови проводили путем
совместного культивирования штамма агробактерий C583l '(pGV3850:: 1103) с
клетками про-эмбриогенной суспензионной культуры моркови [50], как опи-
А Область Т-ДНК pGV 3850 Е Н
1______I_________
НЕ
Арг
ТДНК
Всо RI Hind III
4.0 I 1,55 1 2,5 9,8
| 6,6 4.4 1 3.2 1
Проба, гомологичная левому
участку (4т.п.н.)
I_______________I
Проба, гомологичная правому участку (3,2 т.п.н.)
I___________I
Е Eco RI Н Hind III
Повторы длиной 25 п.и. Размеры в т.п.н.
Б. Область Т-ДНК pGV 3850/pGV 1103 ЕН ЕЕ НЕ
Арг
nos-npt-ll
-*-"-Ь1-
Арг
т-ДНК
| 4,0 |1,55| 2.5 7,3 ~1 ~ 9,8 |
[ 6,6 4.3 I 7,4 1 3,2 |
Проба, гомологичная Проба, гомологичная Проба, гомологичная левому
участку npt-ll (1,0 т.п.н.) правому участку
I-------------1 I-----1 I--;------I
Рис. 6.4, Рестрикционные карты областей Т-ДНК плазмнд pGV3850 н
pGV3850:: 1103.
сано в разд. 2.10. О переносе и включении Т-ДНК судили, исследуя методом
блоттинг-гибридизации по Саузерну ДНК, выделенную из ряда независимо
полученных трансформированных колоний - Т2, ТЗ, Т5, T9 и Т10. Для
иллюстрации подобного подхода часть эксперимента, относящаяся к
определению копий-
Анализ организации и экспрессии генов растений
319
ности и изучению организации перенесенного гена npt-II, будет приведена в
данном разделе. Кроме того, для полноты изложения мы обсудим анализ
пограничных последовательностей, образовавшихся при встраивании этой Т-
ДНК, однако конкретные данные не представлены.
Трансформирующая ДНК
Первое, с чего следует начать при постановке блоттинг-гиб-ридизации по
Саузерну,- это решить, с помощью какой рест-риктазы (рестриктаз) можно
получить требуемую информацию, используя имеющиеся в распоряжении пробы
для гибридизации. Например, для точного определения копийности
необходимо, чтобы вся ДНК встроенного гена умещалась в одном
рестрикционном фрагменте и ее радиоактивный сигнал мог быть сравним с
искусственной "исходной" ДНК. Изучение рестрикционной карты pGV3850: :
1103 (рис. 6.4) показывает, что в случае гена npt-II этого можно
достигнуть с помощью двойного расщепления Hindlll и EcojRI, либо
используя каждый из ферментов по отдельности. Для всех трех случаев