Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 132

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 126 127 128 129 130 131 < 132 > 133 134 135 136 137 138 .. 184 >> Следующая

[5].
Перед гибридизацией с меченой пробой фильтр предварительно инкубируют
в растворе, содержащем разнообразнше сложные макромолекулы с длинной
цепью, главным образом белки (сухое молоко), а также фрагментированную
ДНК из спермы лосося или сельди. Эти молекулы прикрепляются ко всем
участкам фильтра, не связанным с ДНК, и, таким образом, препятствуют
неспецифическому связыванию при гибридизации меченой ДНК. После
гибридизации фильтр тщательно промывают, чтобы удалить всю неспецифически
связанную метку, и зоны гибридизации выявляют радиоавтографией.
5.5.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [ I ]).
- Кипящая водяная баня (например, Gallencamp).
- Жесткий пластмассовый контейнер с плотно закрывающейся крышкой
(например, Gallencamp, № 800058). Чтобы объем гибридизационной смеси был
минимальным, коробка должна иметь такую же поверхность, как и
гибридизуемый фильтр.
- Термостатируемая качалка с водяной баней на 65°С с крышкой (например,
Gallencamp).
1 Подбирая оптимальное время "пришивания" фрагментов ДНК к иайло-
новым мембранам, следует иметь в виду, что оио различается для фрагментов
ДНК разной длины. - Прим. ред. пер.
294
Глава b
- Контейнер (Metal Box pic.) для сухих радиоактивных отходов Р32.
- Стакан из пирекса для жидких радиоактивных отходов.
- Защитный экран для работы с радиоактивным материалом.
- Полимерная пленка (Saran Wrap, Dow Chemical Company).
- Фильтровальная бумага Whatman 3 ММ.
- Рентгеновская пленка (например, Amersham; Hyperfilm-MP).
- Кассеты для рентгеновской пленки (например, X-orgaph Ltd.).
- Фильтровальная бумага с полиэтиленовой подстилкой (Веп-chkote,
Whatman).
- Портативный счетчик радиоактивности (например, Mini-Instruments Ltd.;
серия 900).
Растворы
- 20XSSPE (3 М NaCl, 0,2 М NaH2P04-2H20, 0,Q2 М ЭДТА).
На 1 литр:
NaCl 175,3 г
NaH2P04-2H20 31,2 г
0,5 М ЭДТА 40,0 мл.
Растворяют в 900 мл дистиллированной Н20, доводят pH до 7,7 1,0 М NaOH и
доливают до 1 л дистиллированной Н20.
- Раствор для гибридизации (1,5XSSPE, 0,5% сухое молоко, 1,0% ДСН, 6,0%
ПЭГ, 0,1-0,5 мг/мл ДНК из спермы сельди).
На 100 мл:
20XSSPE 7,5 мл
Сухое молоко (например, Cadburys Marvel)1) 0,5 г
ДСН 1,0 г
ПЭГ (6000 или 8000) 6,0 г
5 мг/мл фрагментированной и денатурированной ДНК из спермы
лосося или сельди (Sigma) 2,0-10 мл.
- Раствор А для отмывания (3XSSC, 0,1% ДСН). На 1 литр:
20XSSC 150,0 мл
ДСН 1,0 г.
- Раствор Б (0,5XSC, 0,1% ДСН). На 1 литр:
20XSSC 25,0 мл
ДСН 1,0 г.
- Радиоактивная проба, меченная с помощью олигонуклеотид-ной затравки
(см. разд. 5.6).
'> Можно использовать отечественное сухое молоко. Для этого готовят
при кипячении 5-10%-ную суспензию, охлаждают, фильтруют н экстрагируют 4-
5. раз гексанолом для удаления липидов. Полученный раствор используют как
десятикратный для гибридизациоиной смеси. -Прим. ред. пер.
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
295
5.5.3. Методика
Предварительная инкубация
1. Наливают в пластмассовую коробку такое количество раствора для
гибридизации, чтобы он образовал слой 0,2-. 0,4 см. Помещают на *10 мин
коробку на покачиваемую водяную баню при 65 °С, чтобы нагреть раствор.
2. Осторожно помещают фильтр в контейнер для гибридизации.
3. Закрывают крышкой и опять помещают на баню на 1-8 ч.
Гибридизация
1. Заменяют раствор в контейнере на 10-40 мла> предварительно прогретого
(65°С) свежего раствора для гибридиза-
. ции.
2. Денатурируют меченую пробу для гибридизацииб), проинкубировав ее в
течение 5 мин на кипящей водяной бане (чтобы крышка пробирки Эппендорф не
откидывалась, следует проколоть в ней отверстие). Помещают пробирку на
лед.
3. Надев перчатки и подложив новый лист фильтровальной бумаги с
полиэтиленовой подстилкой, вырезают острым скальпелем кусок пленки (Saran
Wrap) по размеру контейнера, используя его как шаблон. Продолжая работать
на фильтровальной бумаге с полиэтиленовой подстилкой и за защитным
экраном, добавляют денатурированную пробув) к гибридизационной смеси, а
затем осторожно покрывают ее поверхность^ пленкой (Saran Wrap), стараясь
избежать попадания пузырьков воздуха.
4. Заклеивают контейнер клейкой лентой со значком радиоактивности и
помещают на покачиваемую водяную баню при
65 °С на 3-16 ч".
5. Надев перчатки и подложив фильтровальную бумагу с полиэтиленовой
подстилкой, удаляют пленку и выбрасывают ее в контейнер для твердых
отходов. Осторожно извлекают фильтры из контейнера для гибридизации,
помещают в пластмассовую коробку для отмывания, в которую добавлено 150
мл предварительно прогретого до 65 °С раствора А, и ополаскивают. Сливают
этот раствор в раковину для радиоактивных отходов либо в специальный
Предыдущая << 1 .. 126 127 128 129 130 131 < 132 > 133 134 135 136 137 138 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed