Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
См. примечание ж) и далее о калибровке различных источников УФ-света.
15. Теперь фильтр можно хранить внутри сложенного листа фильтровальной
бумаги в сухом месте либо сразу же использовать для гибридизации ДНК-
Примечания
а) Апуринизация приводит к фрагментации больших молекул ДНК, что повышает
эффективность их переноса.
¦(r)) 30 мии - это минимальное время инкубации. Если используют
высококачественную агарозу (например, Miles Scientific; SeaPlaque), то
время инкубации можно увеличить до 2-3 ч. В случае неполной нейтрализации
геля нитроцеллюлоза становится весьма ломкой, а в некоторых случаях
разрушается полностью. Таким образом, если возможно, лучше нейтрализовать
дольше чем 30 мии.
•> Найлоновые фильтры в отличие от нитроцеллюлозных связывают нуклеиновые
кислоты в буферах с низкой ионной силой, что позволяет осуществ-.лять
электроперенос при низких концентрациях солей [1, 4, 8].
1) Нейтрализуют гель 1 М фосфатом натрия (pH 6,5) в течение 30 мин.
2) Электрофоретически переносят ДНК в полусухом приборе для блоттинг-
гибридизации в 25 мМ фосфате натрия (pH 6,5) при 4°С в течение
2 ч (27 В, 0,9 А).
3) Фиксируют ДНК на подложке, как на стадии 14 разд. 5.4.3. В связи с
тем, что прогревание резко снижает эффективность гибридизации на многих
найлоновых фильтрах [4], ДНК следует фиксировать на фильтре с помощью
сшивок при облучении УФ-светом.
Фильтр Hybond гидрофилен, н, следовательно, в отличие от нитроцеллю-
292
Глава 5
лозного (который приходится смачивать 3XSSC) его ие требуется
увлажнять перед помещением на гель.
По опыту автора для эффективного сшивания ДНК с иайлоиовым фильтром
важно, чтобы фильтр был абсолютно сухим. е) Для облучения ультрафиолетом
не обязательно заворачивать фильтр в иленку (Saran Wrap).
*) Чтобы откалибровать источник УФ-света, используемый для определенного
найлонового фильтра, необходимо осуществить простой контрольный перенос.
В лаборатории автора определяли эффективность гибридизации ДНК,
перенесенной на Hybond в зависимости от дозы ультрафиолетового света,
измеренной дозиметром УФ-излучения. Оптимальная доза при этом составляла
14 мВт/см2/с в течение 4 с.
Судя по имеющимся данным, хможно предположить, что в случае переноса
под действием капиллярных сил при высокой ионной силе [4] различные
найлоновые фильтры мало различаются по эффективности гибридизации ДНК.
Этот факт может оказаться полезным при калибровке источников УФ-света вне
зависимости от типа фильтра - достаточно лишь иметь дозиметр! Если
дозиметр отсутствует, калибровку можно осуществить следующим образом:
1) Проводят электрофорез и переносят на найлоновый фильтр до 10 аликвот,
содержащих по 1 нг рестрицированной ДНК, для которой приготовлена
гомологичная проба. Следует отметить расположение каждой дорожки таким
образом, чтобы отдельные зоны ДНК можно было облучать по отдельности.
2) Помещают источник УФ-света (например, лампу Phillips-TUV, 15 Вт) на
определенном расстоянии, а под ним на бумаге Whatman 3 ММ располагают
фильтр таким образом, чтобы сторона, содержащая ДНК, была бы обращена
кверху. Большинство современных хемископов обладают очень высокой
мощностью, и некоторые из них могут оказаться неподходящими для получения
контролируемых сшивок при облучении УФ-светом. Тем не менее если для
облучения используют хемископ, то фильтр должен быть положен на его
стекло той стороной, которая несет ДНК.
3) По отдельности облучают каждую дорожку, оставив одну из них
необлученной. Для каждой следующей дорожки увеличивают время облучения на
1 мин. В начале целесообразно облучать от 0 до 10 мин с интервалом в 1
мин, но впоследствии могут потребоваться и интервалы в 30 с. Если для
облучения используют хемископ и фильтр помещают непосредственно на него,
то сроки облучения могут быть гораздо короче.
4) Проводят гибридизацию, как указано в разд. 5.5. Сравнивают сигнал,
полученный для каждого интервала облучения, и рассчитывают оптимальную
дозу либо в случае необходимости проводят дополнительный эксперимент.
Сравнивают сигналы с результатами, полученными на прогретом фильтре,
поскольку обработка УФ-светом должна повышать интенсивность сигнала:
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
293
примерно з пять раз. Если этого не происходит, значит, продолжительность
облучения УФ-светом скорее всего определена неверно1.
5.5. Гибридизация ДНК, перенесенной на мембраны с помощью блоттинга по
Саузерну
5.5.1. Общие положения
Теперь однодепочечную ДНК, связанную с фильтром, можно "испытать"
одноцепочечной радиоактивно меченной ДНК пробы, находящейся в растворе.
Проба связывается лишь с ДНК, которая обладает по отношению к ней высокой
степенью гомологии. Точность взаимодействия или строгость гибридизации
(доля неспаренных нуклеотидов, которую допускают данные условия
гибридизации) можно изменять, подбирая разные концентрации соли или
температуру гибридизации либо используя различные растворы для отмывания
