Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
эфира (насыщенного ТЭ-буфером) и перемешивают.
280
Глава 5
4) Удаляют органическую (верхнюю) фазу и осаждают нуклеиновую кис*
лоту, добавив 2,5 объема холодного (-20 °С) этанола. Перемешивают и затем
инкубируют в смеси сухой лед/этанол в течение 15 мин.
5) Собирают осевшую ДНК центрифугированием при 12 000 об/мин в мини-
центрифуге в течение 10 мин. Промывают осадок 70%-ным спиртом:
6) Осторожно сливают супернатант и высушивают под вакуумом осадок,,
который иногда не виден.
7) Ресуспендируют осадок в стерильной дистиллированной Н20 и отбирают
аликвоту для обработки вторым ферментом.
*) Количество обрабатываемой ДНК в большой степени зависит от ее
источника [например, очищенный препарат плазмидной ДНК или мини-препарат
(разд. 1.8), тотальная ДНК агробактерий (разд. 1.11) либо геномная ДНК
растений (разд. 6.2.3)], от числа ожидаемых сайтов рестрикций!' и размера
дорожки в агарозном геле, в котором проводят фракционирование.
г) Буфер для хранения рестриктаз часто содержит 50%-ный глицерин, а
поскольку концентрации глицерина выше 5% влияют на активность большинства
ферментов, объем вносимого фермента не должен превышать 10% объема
реакционной смеси.
*> Время инкубации можно варьировать как для удобства, так и в
зависимости от концентрации ДНК, наличия примесей в препарате или низких
концентраций рестриктаз. е> После добавления буфера для нанесения на гель
препараты должны быть, сразу же нанесены на агарозный гель для анализа
либо, если объем велик, ДНК можно сконцентрировать осаждением спиртом
(см. выше стадии 4 - 7 или примечание б).
5.3. Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле
5.3.1. Общие положения
Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе -
это наиболее удобный метод анализа как ДНК" так и РНК. В данной главе
изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно
обработанной рестрик-тазами. Метод основан на том, что скорость миграции
линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине.
Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины,
а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с
маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении
ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим
красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод
окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать
зоны, содержащие всего"
2 нг ДНК.
Скорость миграции ДНК в агарозном геле определяется в; основном
размером молекулы ДНК, ее конформацией и концентрацией агарозы. Линейные
двухцепочечные молекулы ДНК.
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
281
мигрируют в агарозе со скоростями, обратно пропорциональными десятичному
логарифму их мол. массы [3]. Таким образом, для калибровки необходимо
построить линейный график, яанося на оси координат пройденный путь в
зависимости от lg мол. массы соответствующего маркера. Концентрация
агарозы значительно влияет на скорость миграции молекул ДНК в геле.
Молекулы ДНК одного размера мигрируют с разными скоростями в тех гелях,
которые имеют различные концентрации агарозы. Таким образом, для
достижения желаемого разделения фрагментов ДНК необходимо тщательно
подобрать концентрацию агарозы. Это обстоятельство может оказаться и
преимуществом, поскольку, варьируя концентрацию агарозы, ¦можно разделять
фрагменты ДНК в широких пределах мол. массы. Например, большие фрагменты
ДНК (5 - 60 т. п. н.) можно разделять в гелях с низкой концентрацией
(0,3%), а небольшие фрагменты (0,1 - 3,0 т. п. н.)-в гелях с высокой (2%)
концентрацией агарозы. Чаще всего используют гели с концентрацией агарозы
0,8%, в которых достигается успешное разделение фрагментов от 0,5 до 10
т. п. н. Кольцевые формы ДНК, например плазмиды, ведут себя в геле не
так, как линейные фрагменты: замкнутая кольцевая (I) открытая кольцевая
(П) и линейная (III) формы одной и той же плазмидной ДНК мигрируют в
агарозном геле с разной скоростью.
5.3.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1[1]).
- Высококачественная агароза с высокой температурой плавления
(например, Miles Scientific, HGT)a).
- Столик для заливки геля с уровнем.
- Комплект для горизонтального электрофореза (например, LKB, Biorad,
BRL).
- Клейкая лента (например, "Скотч"),
- Источник питания для электрофореза (например, источник постоянного
тока LKB 2197, 2500 В, 250 мА, 100 Вт).
- Пленка "Поляроид" тип 57.
- Камера "Поляроид", снабженная красно-оранжевым фильтром (Wratten
23А).
- Трансиллюминатор (хемископ) (например, УФ Products Ltd.), снабженный
защитным щитом из оргстекла (толщиной по крайней мере 5 мм) или стекла;
красно-оранжевый "фильтр может быть составной частью щита.
282
Глава 5
Растворы
- Десятикратный буфер для электрофореза, содержащий трис-ацетат и ЭДТА
