Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
рестриктазами, электрофореза в агарозном геле, а также переноса и
гибридизации по Саузерну. Этот подход составляет основу многих методик,
описанных в гл. 1, 3, 4 и 6.
Основная задача данной главы - дать общее представление о
рестрикционной обработке различных препаратов ДНК. Подробные указания по
обработке "мини-препаратов" ДНК Е. coli, тотальной ДНК агробактерий и ДНК
растений приведены в соответствующих разделах гл. 1 и 4. Указания по
нанесению рестрицированных образцов ДНК и детали, связанные с
приготовлением индивидуальных проб для гибридизации по Саузерну, широко
освещены в других разделах (гл. 1 и 4). Способ заливки агарозных гелей,
блоттинг-гибридизация по Саузерну и мечение ДНК с помощью
олигонуклеотидной затравки, приведенные в данном разделе, универсальны
для всех описанных в других разделах экспериментов и могут применяться
без изменений.
277
278
Глава 5
5.2. Обработка ДНК ферментами рестрикции
5.2.1. Общие положения
Рестриктазы, впервые открытые благодаря их действию на* чужеродную
ДНК, попавшую в бактериальную клетку, представляют собой основной рабочий
инструмент молекулярного-биолога. К настоящему времени охарактеризованы
многочисленные ферменты рестрикции, но наибольшее внимание уделяется
ферментам типа II, поскольку именно они узнают определенные
последовательности нуклеотидов внутри или окола-сайта их действия и
разрезают обе нити двухцепочечной молекулы ДНК определенным образом.
Обычно за единицу (ед.) активности рестриктазы принимают активность, при
которой'
1 мкг ДНК фага X разрезается за 1 ч при 37°С (либо при иной-температуре)
в оптимальных условиях. На активность фермента может влиять ряд факторов:
температура, ионный состав-буфера, метод выделения ДНК и соответственно
степень ее загрязнения, а также уровень и специфичность метилирования
ДНК. В связи с тем что имеющиеся в продаже препараты рестриктаз
высокоочищены, при увеличении длительности инкубации и использовании
большего количества фермента либо и того и другого вместе многие
проблемы, связанные с количеством препарата ДНК вполне можно
игнорировать.
При обычной обработке ДНК рестриктазами удобно проводить реакцию в
небольшом объеме, например в 20-40 мкл,. когда раствор ДНК, десятикратный
буфер и фермент доводят до нужного объема стерильной дистиллированной
Н20.
Хотя для каждого фермента оптимальный состав буфера свой, чаще всего
используют три типа буфераа>:
десятикратный с высокой ионной силой: 100 мМ трис pH 7,5
100 мМ MgCl2 1000 мМ NaCl
десятикратный со средней ионной силой: 100 мМ трис, pH 7,S
100 мМ MgCl2 10 мМ ДТТ 500 мМ
NaCl
десятикратный с низкой ионной силой: 100 мМ трис, pH 7,5
100 мМ MgCl2 10 мМ ДТТ.
Если необходимо провести обработку одного препарата-ДНК несколькими
рестриктазами, то конечные концентрации компонентов буфера каждый раз
доводят до нужных значе-нийб).
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну 279
¦5.2.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Водяная баня на 37°С (для некоторых ферментов необходима другая
температура).
Растворы
- Образец ДНК (точно или приблизительно определенной концентрации).
- Десятикратный буфер для рестриктазыа)'б>.
- Стерильная дистиллированная НгО.
5.2.3. Методика
1. Оттаивают раствор ДНК на льду и определяют объем, необходимый для
обработки рестриктазамив>.
"2. Добавляют в надписанные пробирки требуемый объем дистиллированной
Н20, 0,1 объема соответствующего десятикратного буфера для рестрикции,
необходимое количество ДНКВ> и на последнем этапе - рассчитанное
количество рестриктазыг>.
Компоненты реакции:
Десятикратный буфер для рестрикции 10%
Раствор ДНК максимум 80%
Рестриктаза максимум 10%
Дистиллированная НгО до 100%
3. Перемешивают и инкубируют при 37 °С от 60 мин до 18 чд>'е>.
Примечания
л) Многие производители рестриктаз в настоящее время поставляют
специально подобранный для них буфер.
Если для получения определенного фрагмента требуется обработка двумя
рестриктазами, активными в совершенно разных буферах, а также когда
необходимо удалить один из ферментов, можно использовать изложенный ниже
метод, чтобы получить промежуточный продукт для последующих
экспериментов.
1) Проводят первую реакцию, как описано выше.
2) Добавляют 180 мкл ТЭ-буфера (10,0 мМ трис-НС], pH 7,6; 1,0
мМ
ЭДТА, pH 7,6) и ацетат натрия, pH 5,2, до конечной концентрации 0,25
М. Добавляют равный объем смеси фенол/хлороформ (1 : 1, уравновешивают
ТЭ-буфером) и перемешивают. Отделяют водную фазу от органической
центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 3 мии.
3) Осторожно собирают верхний (водный) слой, добавляют равный объем