Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
элюировать из агарозного геля. Вместо этого полосу, содержащую известное
количество нанесенной на гель ДНК, локализуют с помощью хемископа и
вырезают из геля. Кусочек геля взвешивают, рассчитывают в нем количество
ДНК и аликвоту, в которой содержится только 10 нг ДНК, используют
непосредственно в реакции. Перед мечением кусочек агарозы расплавляют на
кипящей водяной бане (при этом ДНК одновременно денатурирует и выходит из
агарозы), затем его охлаждают до 37 °С и аликвоту, содержащую 10 нг ДНК,
вно-
1 Наиболее чувствительная отечественная экранная пленка - РМ-В;
практически аналогичной чувствительностью обладают экранные пленки РМ-1,
РТ-2 и HS-11 (ГДР). - Прим. ред. пер.
298
Глава 5
сят в реакционную смесь. Реакционная смесь содержит гексамеры
дезоксирибонуклеотидов (олигомеры) со случайными последовательностями.
Эти олигонуклеотиды связываются с одноцепочечной ДНК пробы в областях
гомологии и служат затравками для фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I.
Этот фермент полимеризует дезоксирибонуклеотиды, присутствующие в
реакционной смеси. Поскольку один из этих дезоксирибонуклеотидов помечен
32Р, то проба оказывается высоко меченной. Реакцию проводят при комнатной
температуре в течение 4- 5 ч (можно также оставить на ночь). Реакцию
останавливают простым по составу раствором и смесь кипятят, чтобы
образовались одноцепочечные молекулы, готовые для добавления в
гибридизационную смесь.
5.6.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Оборудование, необходимое для обработки ДНК рестриктазами (разд. 5.2)
и для электрофореза (разд. 5.3.1).
- Агароза с низкой температурой затвердевания (например, Miles
Scientific; SeaPlaque).
Кипящая водяная баня.
- Водяная баня 37°С.
Растворы
- Буфер для мечения (OLB, от англ. oligolabelling buffer) готовят при
смешивании трех отдельных растворов:
Раствор А:
2 М трис-НС1, pH 8,0 5 М MgCl2
Дистиллированная Н20
625 мкл (разд. 6.7.2.1)
25 мкл 350 мкл 18 мкл
2-МЭ
dATP
dTTP Pharmacia dGTP
5 мкл 5 мкл 5 мкл
каждый нуклеотид по отдель ности в 3 мМ
Растворяют
трис-НС1 (pH 7,0), 0,2 М ЭДТА в концентрации
0,1 М. Раствор следует хра-
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
299
НИТЬ при -20
°С.
Раствор В: (2 М. HEPES, pH 6,6). На 100 мл: растворяют
47,66 сухого HEPES в 75 мл дистиллированной Н20, доводят pH до 6,6 NaOH,
доливают до 100 мл дистиллированной Н20. Хранят при 4°С.
Раствор С: гексадезоксирибонуклеотиды (Pharmacia, кат.
№ 27-2166-01) тщательно суспендируют (полностью они не растворяются!) в 3
мМ трис-НС1, 0,2 М ЭДТА (pH 7,0) до поглощения OD26o = 90 ед./мл и хранят
при -20 °С. Для приготовления OLB смешивают растворы А, В и С в
соотношении 2:5:3. OLB, хранящийся при -20 °С, остается стабильным по
крайней мере в течение 3 мес при постоянном замораживании-оттаивании.
,
- БСА: 10 мг/мл (препарат, свободный от ДНКаз, кат. № 27-8915-01). Хранят
при 4°С.
- dCTP (Amersham РВ10205, 3000 Ки/ммоль, 10 МКи/мл).
- Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I: 1 ед./мкл, кат.
№ 27-0928-01).
- Стоп-раствор (20 мМ NaCl; 20 мМ трис-НС1, pH 7,4; 2 мМ
- Стерильная дистиллированная Н20.
- ДНК плазмиды, несущей нужный фрагмент ДНК-пробы. Примечание: набор для
мечения с помощью олигонуклеотидной затравки, содержащий те же реагенты,
поставляется фирмой Amersham.
5.6.3. Методика
Приготовление пробы
В качестве примера мы приводим получение гипотетической ДНК-пробы,
клонированной в составе небольшого вектора. Длина вектора составляет 2 т.
п. н., а длина вставки, используемой в качестве пробы,- 1 т. п. н. Таким
образом, вставка составляет 1/3 длины рекомбинантной плазмиды.
1. Обрабатывают 1,5 мкг плазмиды такой рестриктазой, которая вырезает
только вставку (см. подробнее разд. 5.2).
2. Разделяют расщепленную ДНК в геле 0,6%-ной агарозы, содержащей БЭ
(разд. 5.3), обеспечив хорошее разделение
ЭДТА; 0,25%-ный ДСН).
На 20 мл:
5.0 М NaCl
2.0 М трис-НС1, pH 7,4
0,5 М ЭДТА 10%-ный ДСН
80.0 мкл
200.0 мкл
80.0 мкл 0,5 мл.
300
Г лава 5
вставки и вектора. Разделение можно контролировать с помощью
переносной УФ-лампы.
3. Аккуратно вырезают зону из геля, помещенного на хемископ, и удаляют
избыток агарозы.
Примечание: Следует надеть защитную маску, закрывающую все лице.
4. Переносят "усочек геля в предварительно взвешенную центрифужную
пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, взвешивают ее и
определяют вес кусочка геля.
5. Такой кусочек агарозы содержит достаточное для нескольких реакций
количество ДНК-пробы. Следовательно, необходимо вычислить объем агарозы,
используемый для каждого мечения:
Вес кусочка агарозы 100 мг
Плотность геля 1,0 г/мл
Количество вставки 0,5 мкг (1/3 от 1,5 мкг) =
