Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
стакан из пирекса, чтобы вылить позже в контейнер для отходов. Повторяют
эту процедуру триждые>. Растворы для промывания должны быть
предварительно прогреты.
6. Дважды промывают фильтры в течение 30 мин на покачиваемой водяной бане
при 65 °С, используя каждый раз по 150 мл раствора А для отмывания.
296
Глава 5
7. Дважды тщательно промывают фильтры по 15 мин в 100 мл раствора Б для
отмывания. Для контроля за отмыванием радиоактивности можно использовать
переносной счетчик.
8. Высушивают фильтры НуЬопс1-Мж> на воздухе между листами бумаги Whatman
3 ММ, помещают их на новый кусок той же бумаги и завертывают в пленку
(Saran Wrap). Помещают на экспозицию с рентгеновской пленкой3) на -70 °С
в специальных кассетах, снабженных усиливающими экранами.
Примечания
*> Во избежание высокого фона очень важно подобрать соответствующую
концентрацию пробы. Рекомендуется использовать концентрации менее
0,5 нг/мл. При такой концентрации для 10 нг пробы, образующейся в
результате одной стандартной реакции с использованием олигонуклеотидной
затравки, потребуется 20 мл гибридизационной смеси. Следует заметить, что
при такой весьма низкой концентрации необходимо, чтобы проба обладала
высокой удельной радиоактивностью (>5ХЮ7) и чтобы гибридизация
стимулировалась высокомолекулярными соединениями, например ПЭГ 6000 или
8000 [6].
6> Важно, чтобы ДНК была полностью денатурирована, поскольку
двухцепочечная проба не сможет связаться с гомологичными
последовательностями на фильтре.
Количество радиоактивной метки, используемой при гибридизации, зависит
от относительного содержания гомологичных последовательностй ДНК, которые
предположительно присутствуют на фильтре. Как правило, достаточно 106
имп/мин/мкг ДНК, однако для выявления последовательностей одной копии
гена в геномах растений может потребоваться проба с удельной активностью
порядка 109 имп/мин/мкг ДНК.
г> Необходимо следить, чтобы во время гибридизации или отмывания фильтр
не пересыхал. Это может произойти, если гибридизация и отмывание
проводятся в недостаточно герметичной коробке. Данные стадии лучше
проводить в запаянном полиэтиленовом пакете, либо в специально
сконструированной для этих целей гибридизационной камере из оргстекла.
Д| Продолжительность гибридизации зависит от комплексности связанной с
фильтром ДНК, а также от удельной активности и концентрации пробы. Для
гибридизации с полосой клонированного фрагмента, содержащего 100 нг ДНК,
требуется инкубация в течение всего лишь 2-4 ч при стандартных условиях и
активности пробы 1-5ХЮв имп/мин с удельной активностью 109 имп/мин/мкг. В
зависимости от комплексности для гибридизации тотальной ДНК эукариот
может потребоваться 12-16 ч.
е) Условия отмывания зависят от требуемой строгости гибридизации.
Описанные в данной методике условия подходят для относительно высокой
точности спаривания оснований. Строгость можно повысить, повышая
температуру растворов для отмывания и/или снижая концентрацию ДСН.
*) Если фильтр предназначен для повторного использования, он не должен
пересыхать. С него удаляют пробу следующим образом;
1) Инкубируют фильтр при 45 °С в течение 30 мин в 100 мл 0,4 М NaO'H.
2) Переносят в 100 мл 0.1XSSC, 0,1% ДСН, 0,2 М трис-НС1, pH 7,5, и
затем инкубируют при 45 °С в течение 30 мин.
3) Проводят радиоавтографию фильтра, чтобы убедиться в отсутствии
пробы.
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
297
4) Как обычно, предварительно инкубируют фильтр либо хранят при 4°С
завернутым в пленку.
(r)> Известны разнообразные виды рентгеновской пленки. Amersham Нурег-film-
MP- одна из самых чувствительных и обеспечивает хороший контраст1.
5.6. Мечение препаратов для гибридизации с помощью олигонуклеотидной
затравки
5.6.1. Общие положения
Мечение с использованием в качестве затравки олигонуклеотидов [2]
позволяет получить комплементарные пробы ДНК, обладающие высокой
радиоактивностью, и представляет собой значительный шаг вперед по
сравнению с методом ник-трансляции. Принцип усовершенствования состоит в
использовании в качестве субстрата при мечении очищенного фрагмента ДНК"
что удобно в нескольких отношениях:
- Можно приготовить пробу, комплементарную определенной области
клонированного фрагмента ДНК, например гомологичную 5'- или З'-концу.
- Можно проводить отбор библиотеки кДНК в случае, когда проба не должна
содержать последовательностей вектора.
- Можно приготовить пробу, обладающую высокой активностью, что возможно
лишь в случае, если помечена только вставка, а не вектор.
При мечении с использованием олигонуклеотидной затравки, как и в
случае других методов получения проб с высокой удельной активностью,
используют фрагменты ДНК, отделенные от вектора с помощью обработки
рестриктазами и электрофоретического разделения в агарозе. Однако большое
преимущество мечения с использованием олигонуклеотидов перед другими
методами заключается в том, что перед мечением ДНК не требуется
