Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
(ТАЭ-буфер)б> (400,0 мМ трис-ацетат, pH 8,0; 10,0 мМ ЭДТА).
На 1 литр:
Трис-ОН 48,4 г
0,5 М ЭДТА 20,0 мл.
Доводят pH до 8,0 ледяной уксусной кислотой (примерно
11,4 мл/л). Для получения однократного буфера используют
дистиллированную НЮ. Хранят при комнатной температуре.
- Однократный ТАЭ-буфер + 5,0 мкг/мл бромистого этиди?г (ТАЭ/БЭ-буфер).
На 10 литров:
Десятикратный ТАЭ-буфер 1,0 л
Дистиллированная Н20 9,0 л
5 мг/мл бромистого этидия 10,0 мл
- Буфер для нанесения на гель (50%-ный глицерин; 250 мМ
ЭДТА, pH 8,0; 0,01%-ный бромфеноловый синий). На
100 мл:
Глицерин 50,0 мл
1,0 М ЭДТА, pH 8,0 25,0 мл
Бромфеноловый синий 10,0 мг.
Доводят до 100 мл дистиллированной Н20. Хранят при комнатной температуре.
- Смесь радиоактивно меченной (приложение 5 [II]) и немеченой маркерной
ДНК фага X, обработанной Hindlll (1 мг/мл) Ч
5.3.3. Методика
В связи с тем, что температура, по крайней мере в интервале от 4 до 30
°С, слабо влияет на свойства ДНК при электрофорезе, всю процедуру обычно
проводят при комнатной температуре. Однако гели с низкой концентрацией
агарозы (менее
0.5.) довольно хрупкие, и с ними можно работать при 4°С.
1. Добавляют агарозу к однократному ТАЭ/БЭ-буферуг> в количестве,
необходимом для получения требуемой концентрации и толщины геля 0,5-0,7
см. Полностью растворяют агарозу при кипячениид).
Например, для того, чтобы залить 0,8%-ный гель размером 13X11X0,7 см
следует растворить 0,8 г агарозы в 100 мл однократного ТАЭ/БЭ-буфер а.
2. Готовят чистую форму для геля из оргстекла или обычного стекла,
заклеив края липкой лентой. На расстоянии 2 -
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
283
3 см от одного конца помещают гребенку, убедившись, что
зубья не касаются дна формые), и осторожно наливают в нее
охлажденную*' расплавленную агарозу. Следует избегать образования
пузырьков, особенно вокруг гребенки.
3. Дают агарозе застыть в течение 30-40 мин при комнатной температуре.
При застывании агароза немного мутнеет.
4. Осторожно^ вынимают гребенку и помещают гель в прибор для
электрофореза. В приборе должно содержаться такое количество однократного
ТАЭ/БЭ-буфера, чтобы гель был покрыт им на 1-2 мм3). Подсоединяют11)
прибор к выключенному источнику питания.
5. Рассчитывают количество наносимого образца11)'л). Доводят образец до
20-40 мкл дистиллированной Н20, добавив
3 мкл буфера для нанесения и тщательно перемешивают.
6. Наносят маркерную ДНК фага Яв) на самую крайнюю дорожку, а затем
наносят образцы ДНК, обработанные рест-риктазами.
7. Электрофорез проводят при 25-100 В, пока бромфеноловый синий не будет
находиться в 2-3 см от края геля (3-
10 В/ч/см). Электрофорез может длиться 2-2,5 ч или в течение ночи в
зависимости от хода эксперимента.
8. Качество электрофореза проверяют с помощью хемископам>, а затем гель
фотографируют11' камерой "Поляроид", снабженной красно-оранжевым
фильтром1. На рис. 5.1 показаны полностью рестрицированные и разделенные
путем электрофореза образцы ДНК из разных источников. Полосы
калибровочных фрагментов ДНК (ДНК фага I, рестрици-рованная Hindlll)
должны быть четкими и хорошо разделившимися (дорожка 1), чтобы при
необходимости можно было бы построить калибровочную кривую. Если полосы
разделяются плохо, разрешение можно повысить либо увеличив время, либо
подобрав соответствующую концентрацию агарозы1")'0). Препараты плазмидной
ДНК, обработанной рестриктазой (дорожка 2), должны достаточно хорошо
разделиться, чтобы дальнейшую работу, например приготовление проб (разд.
5.6) либо выделение определенных фрагментов (разд. 1.5), можно было бы
проводить без затруднений и иметь незагрязненные препараты. При
электрофорезе рестрицированной тотальной ДНК агробактерий обычно видно
множество полос различной интенсивности (дорожка 3), тогда как при
рестрикции геномной ДНК растительного или животного происхождения
(дорожка 4)
1 У нас в стране гель обычно фотографируют на пленку "Микрат-300>
с
оранжевым светофильтром ОС-12.-Прим. ред. пер.
284
Глава 5
наблюдается более или менее равномерное распределение ДНК по всей
дорожке.
Примечания
а> Известны различные типы агарозы. Главные критерии при выборе типа
агарозы - это цель эксперимента (картирование или очистка фрагментов
ДНК), чистота, твердость и другие подобные свойства, а также'
прозрачность и тугоплавкость (см. также примечание б к разд. 5.4.3).
Рис. 5.1. Рестрицированная ДНК из различных источников после
электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Дорожка 1
-калибровочные фрагменты ДНК бактериофага К, обработанной Hindlll. 2 -
при обработке рестриктазой ДНК плазмиды образуются хорошо различимые
фрагменты. 3 - тотальная ДНК агробактерий, обработанная рестриктазой. 4 -
тотальная ДНК растения, обработанная рестриктазой.
