Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Цитрат натрия 882,0 г
Растворяют в 8 л дистиллированной Н2О и доводят до необходимого
объема. pH раствора обычно не требует доводки.
- Раствор для апуринизации (0,25 М HCI). На 1 литр:
НС1 (плотность 1,16; 10,15 М) 25,0 мл
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну___________?89
Дистиллированная Н20 975,0 мл.
Денатурирующий раствор (0,5 М NaOH, 1,5М NaCl). На
1 литр:
NaOH 20,0 г
5 М NaCl 300,0 мл
Дистиллированная НгО до 1 л.
Раствор для нейтрализации (3,0 М NaCl; 0,5М трис-НС1, pH 7,4).
На 1 литр:
5 М NaCl 600,0 мл (либо 175,3 г соли)
2 М трис-НС1, pH 7,4 250,0 мл
Дистиллированная НгО до 1 л.
3XSSC. На 1 литр:
20XSSC 150,0 мл
Дистиллированная НгО 850,0 мл.
5.4.3. Методика
1. Фотографируют гель в УФ-свете и отмечают положение маркеров, а
также общий вид разделенной ДНК (см. стадию 8 в разд. 5.3.3). Для
облегчения последующих действий иногда удобно поместить гель на кусок
полимерной пленки (Saran Wrap).
2. Переносят гель в пластмассовую коробку и заливают его двумя-тремя
объемами (по отношению к объему геля) раствора для апуринизацииЧ Помещают
на 7 мин на качалку, установленную на небольшую скорость.
3. Сливают раствор, промывают гель дистиллированной водой и заливают
его двумя-тремя объемами (по отношению к объему геля) раствора для
денатурации. Помещают на период от 30 мин до 2 чб> на качалку, как
описано на стадии 2.
4. Сливают раствор, промывают гель дистиллированной водой и заливают
его двумя-тремя объемами (по отношению к объему геля) раствора для
нейтрализации на период от 30 мин до 2 чб). Помещают коробку с гелем на
качалку.
5. Промывают гель дистиллированной водой и собирают прибор для
блоттинг-гибридизации, как указано на рис. 5.2.
>6. Заполняют поднос прибора для блоттинг-гибридизации раствором
20xSSCB) таким образом, чтобы он на 0,5 см не доходил до поверхности
губки. Накрывают губку двумя листами Whatman 3 ММ, вырезанными по размеру
губки, и дают им пропитаться раствором 20XSSC.
7. Отрезают кусок полимерной пленки (Saran Wrap) по размеру губки.
Используя форму для заливки геля в качестве
990
Глава 5
шаблона, вырезают Ъ пленке отверстие по размеру геля и помещают пленку
на губку, покрытую бумагой.
8. Сперва необходимо убедиться, что фильтровальная бумага пропиталась
20XSSC, а затем помещают гель на отверстие, прорезанное в пленке, избегая
попадания пузырьков воздуха между гелем и бумагой.
9. Найлоновые фильтры Hybond проложены двумя предохраняющими их
листами. Ни в коем случае нельзя прикасаться к фильтру руками. Следует
надеть новые одноразовые рези-
Медицинский матрас -объемом 500
мл, заполненный водой
Пластмассовая
крышка
Бумажные
полотенца
Пленка, Наложенная на участки губки, непокрытые гелем
=-
____фильтровальной
бумаги
___Губка, помещенная.
в кювету,
•: содержащую
20 х
SSC
Рис. 5.2. Схема блоттинга по Саузерну.
новые перчатки. В противном случае любое загрязнение может привести к
неспецифическому связыванию ДНК-пробы. Держа фильтр между предохраняющими
его листами, вырезают кусок по размеру геля, опять используя в качестве
шаблона форму для геля. Примечание: необходимо надписать фильтр и
отметить его ориентацию.
10. Помещают сухойг) фильтр Hybond на гель, избегая попадания пузырьков
воздуха между ними.
____• Фильтровальная
бумага
-----Hybond-N
оя-
I
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
291
11. Помещают на фильтр два слоя бумаги Whatman ЗММ, вырезанной по
размеру геля и смоченной 20XSSC (следите, чтобы не попадали пузырьки
воздуха). Закрывают сверху минимум четырьмя листами Whatman 3 ММ,
вырезанными по размеру геля.
12. Помещают поверх бумаги Whatman ЗММ слой бумажных полотенец толщиной
10 см, а на них - кверху дном твердую пластмассовую крышку. Равномерное
давление может обеспечить лежащий на боку медицинский матрас, заполненный
водой из крана. Оставляют на ночь.
13. Осторожно удаляют крышку с грузом и бумагу. Снимают фильтр Hybond,
быстро споласкивают его 3XSSC и высушивают между листами бумаги Whatman
ЗММ при 65°С в течение 20 минЧ
14. Помещают Hybond той стороной, которой он соприкасался с гелем, на
тонкую прозрачную хлорвиниловую пленку типа Saran, прикрывающую фильтр
хемископа, и освещают в течение 4 с. Либо помещают фильтр Hybond на кусок
бумаги Whatman 3 ММе) и освещают ДНК сбоку УФ-светом (например, лампой
Phillips TUV, 15 Вт на расстоянии 12 см в течение 2 мин).
