Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
*> Как ТАЭ, так и ТВЭ (ТВЭ=89 мМ трис-ОН; 89 мМ борная кислота*
2,5 мМ ЭДТА, pH 8,3) широко используются для электрофореза и хранятся
при комнатной температуре в виде десятикратных растворов. Однако при
длительном хранении ТВЭ образует растворимый в щелочи осадок. Оба буфера
можно использовать многократно.
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
28S
Таблица 5.1. Размер фрагментов ДНК фага Я, образующихся при обработке
?coRI и/или Hindlll
IXHindlll (п. н.) XXHindlll+EcoRl (п. я.)
23 130 21 226
9416 5148
6557 4973
4361 4277
2322 3530
2027 2027
564 1904
125 1584
1330
983
831
564
125
в> Обычно в качестве маркера используют ДНК фага Я, обработанную' Hindlll
или Hindlll и EcoRl. Размеры образующихся (п.н.) при этом фрагментов ДНК
приведены в табл. 5.1.
Ряд фирм поставляют маркеры, уже готовые к употреблению. Например,
Boeringer Mannheim: ДНК фага X, обработанная HindIII, кат. № 236250; ДНК
фага Л, обработанная ?coRI и HindIII, кат. № 528552. Для блоттинг-
гибридизации по Саузерну часть препарата фрагментов ДНК фага X может быть
помечена концевой меткой (приложение 5 [II]),
и, таким образом, положение маркеров может быть выявлено при
радиоавтографии.
г> В табл. 5.2 указаны концентрации агарозы, подходящие для эффективного
разделения линейных молекул ДНК разного размера. д> Агарозу удобнее всего
растворять, доводя до кипения в микроволновой, печи при периодическом
помешивании. Внимание-, во время нагревания необходимо убедиться, что
крышка флакона закрыта неплотно. Кроме того, агарозу можно растворять,
осторожно нагревая ее на водяной бане-над газовой горелкой, постоянно
перемешивая во избежание подгорания либо нагревая паром, при этом следует
следить, чтобы сконденсировавшийся пар не попал в сосуд. Иногда
необходимо дважды доводить агарозу до кипения, встряхивая ее, чтобы
убедиться, что произошло полное растворение.
е> Зубья гребенки не должны доходить до дна на 0,5-1,0 мм, чтобы дно
лунок было закрыто агарозой. Необходимо и очень осторожно вынимать
гребенку, чтобы не повредить лунки. Из поврежденных лунок или лунок с
дырявым дном образец вытекает. ж> Во избежание повреждения формы для
геля, изготовленной из оргстекла, перед заливкой агарозу следует охладить
примерно до 50 °С. а> Сопротивление геля и буфера примерно одинаково, и,
следовательно, ток в основном проходит через гель.
"> ДНК мигрирует от минуса к плюсу или "от большего к меньшему" - это
очень удобно для проверки полярности и связано с тем, что на
отрицательном электроде образуется гораздо больше пузырьков, чем на
положительном.
в) Если продукты расщепления чистой плазмидной ДНК рестриктазами
требуется выявить с помощью окрашивания бромистым этидием, то следует
:286
Глава 5
Таблица 5.2. Оптимальная концентрация агарозы для разделения фрагментов
ДНК различного размера
Концентрация агарозы (%) Пределы разделения (т. п. н.)
0,3 5---60
0,6 1---20
о., 7 0,8---10
0,8 0,5---10
0,9 0,5---7
1,2 0,4---6
1,5 0,2---4
2,0 0,1---3
нанести около 0,1 мкг ДНК в расчете на каждую предполагаемую зону.
Если фрагменты необходимо проанализировать методом блоттинг-гнбри-дизации
по Саузерну, то не следует наносить более 1 - 10 нг ДНК на одну полосу,
чтобы избежать получения "выжженных" автографов, где могут оказаться
неразличимыми важные детали. Поведение тотальной ДНК агробактерий менее
предсказуемо, однако в большинстве случаев для блоттинг-гибридизации по
Саузерну достаточно нанести количество ДНК, соответствующее 106-107
геномам (10-100 нг). Максимальное количество ДНК, которое можно нанести в
одну лунку, не перегружая ее11, составляет около 10 мкг. Для организмов с
большими геномами, как у растений, это ограничение означает, что в каждой
зоне содержится относительно мало ДНК, следовательно, при блоттинг-
гибриднзации по Саузерну потребуется максимальная эффективность. И в этом
случае следует наносить количество ДНК, соответствующее 106-107 геномам,
что для большинства высших растений составляет 5-10 мкг ДНК (разд.
6.2.3, примечание а).
~*> Минимальное количество ДНК, которое может быть выявлено окрашиванием
БЭ в полосе геля шириной 0,5 см, составляет приблизительно
