Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
пограничным областям Т-ДНК, однако их сайты рестрикции могут быть
непредсказуемы.
Анализ числа пограничных и составных фрагментов можно использовать для
определения содержания отдельных вставок Т-ДНК (число вставок) в
трансформированной ткани. "Копий* ность" (т. е. общая копнйность всех
типов вставок Т-ДНК в трансформированной ткани) определяют, сравнивая
интенсивность внутренних фрагментов с полосами исходной Т-ДНК на
радиоавтографах.
J. Отмечают каждую полосу на радиоавтографе, которая обладает той же
подвижностью, что и исходная Т-ДНК. Определяют, какому разведению
исходной Т-ДНК соответствуют полосы, и вычисляют число копий на
гаплоидный геном для каждой из полос. Данные полосы могут оказаться
внутренними фрагментами, что должно быть проверено либо путем обработки
другими рестриктазами, либо путем получения перекрывающихся проб.
2. Отмечают на радиоавтографе каждую полосу, которая имеет отличную от
исходной Т-ДНК подвижность. Если таких полос несколько и копийность
внутренних фрагментов более 1 на геном, то в этом случае полосы,
обладающие иной, чем внутренние фрагменты, подвижностью, могут оказаться
либо а) пограничными фрагментами, либо б) составными фрагментами.
а) Если полосы очень слабые, то скорее всего это пограничные
последовательности, что проверяют гибридизацией с правым или левым концом
(рис. 6.3,Л). Очевидно, что пограничные последовательности должны
гибридизоваться с одним из концов. В случае простых вставок, число
фрагментов, содержащих левую или правую границу, должно равняться
копийности вставок (рис. 6.3,5). Если это не так (т. е.
неидентифицированных полос меньше, чем полос, соответствующих внутренним
фрагментам!), то эти полосы могут содержать составные фрагменты (см. ниже
пункт б).
б) Если полосы дают сильный сигнал, а копийность внутренних
фрагментов больше 1, то эти полосы, вероятно, содержат составные
фрагменты (рис. 6.3, Г). В таком случае интенсивность составных
фрагментов должна приближаться
316
Глава б
к интенсивности внутренних фрагментов. Присутствие в полосе составных
фрагментов можно выявить, определив, гиб-ридизуются ли они с пробами
левого и правого конца или с одной из них. Если полосы гибридизуются с
обеими пробами, то это могут быть составные фрагменты, получившиеся при
тандемном встраивании. Если они, с другой стороны* гибридизуются только с
одной из проб, то это может оказаться зона, содержащая составные
фрагменты, которые образовались при соединении обратных тандемных
вставок, либо в этой зоне содержатся перестроенные фрагменты. При
возникновении тандемных вставок (прямых пли обратных) мол. массу
составных фрагментов можно предсказать (рис.
6.3, Г).
3. Если полосы не соответствуют ни одному из приведенных выше критериев,
скорее всего они состоят из перестроенных фрагментов и их анализ методом
блоттинг-гибридизации п" Саузерну может оказаться затруднительным. Для
дальнейшего изучения такие полосы можно одновременно расщепить двумя
рестриктазами, кроме того, использовать короткие специфические пробы и
рестриктазы, узнающие последовательности из четырех нуклеотидов. Если
результат и в этом случае трудно интерпретировать, то эти
последовательности следует клонировать и определить в них порядок
нуклеотидов.
Описанный выше метод предназначен для изучения тканей растений,
трансформированных векторами на основе Ti-плазмид. В такой системе на
концах перенесенной ДНК находятся повторы длиной 25 п. н. Весьма
вероятно, что перед встраиванием Т-ДНК способна образовывать линейные
конкатемеры и затем встраиваться в виде линейной молекулы. Таким образом"
перед анализом можно сделать предварительную прикидку, какие фрагменты Т-
ДНК можно ожидать в следующих случаях (рис. 6.3):
- Одна простая вставка на геном.
- Две или более отдельных вставок на геном.
- Две или более сцепленные копии в виде прямого или об* ратного
тандемного повтора.
- Сочетание любых из трех приведенных выше событий. Каждая из
гибридизующихся полос, не удовлетворяющая
ни одному из этих условий, может образовываться в результате вставок,
содержащих делеции на любом из концов Т-ДНК, либо нести Т-ДНК,
последовательности которой перемешаны при рекомбинации на одной из стадий
до или после встраивания. Весьма важно, чтобы в подобном исследовании
ткани состояли исключительно из трансформированных клеток одного типа..
Подобный анализ лучше всего проводить на трансформирован-
Анализ организации и экспрессии генов растений
317
ных колониях, полученных из одного клона, или, что предпочтительнее, на
трансформированных растениях. Ткани, образующиеся при трансформации
больших гетерогенных эксплантатов, могут содержать разнообразные типы
трансформированных клеток, а также нетрансформированные клетки, что
затрудняет интерпретацию результатов, полученных методом блоттинг-
гибридизации по Саузерну. Следовательно, перед тем как исследовать Т-ДНК,
рекомендуется уточнить, к какому клону принадлежит изучаемая ткань.
