Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
необходимо отметить следующее. Во-первых, при этом образуется фрагмент,
включающий в себя все последовательности, гомологичные ДНК-пробе; причем
проба гибридизуется только с одной полосой на фильтре, и, во-вторых, эти
фрагменты не содержат пограничных последовательностей Т-ДНК, что вызвало
бы появление большого числа гибридизующихся полос, если множественные
вставки происходят более чем по одному сайту ДНК растения.
Для выявления пограничных фрагментов, содержащих участок соединения Т-
ДНК и ДНК растения, ДНК следует обработать Hindlll. Образующиеся при этом
фрагменты обладают следующими важными свойствами: 1) включают в себя
повтор-размером 25 п.н. из Т-ДНК, а следовательно, содержат часть
пограничного фрагмента, если он встроился в ДНК растения; 2) в
достаточной степени перекрывают соответствующую пробу ДНК, что при
гибридизации обеспечивает сильный сигнал. Принимая во внимание второй
пункт, можно оценить гомологию между пробой, содержащей пограничный
фрагмент, и пограничным фрагментом, образующимся в результате обработки
?coRI.
Исходная ДНК
Для правильной интерпретации данных, полученных в результате блоттинг-
гибридизации по Саузерну, и для получения максимального количества
информации на фильтр следует нанести различные образцы исходной ДНК.
Такая исходная ДНК важна для определения копийности гена или изучаемой
320
Глава 6
последовательности. Чаще всего в качестве исходного используют
переносимый ген в копийности IX, 5Х и 10Ха). Для растений,
трансформированных pGV3850:: 1103, удобно использовать препарат
Sail/Hindlll фрагмента плазмиды pNCAT4 (рис. 5.7), содержащего ген nptll,
смешанный с соответствующим количеством контрольной ДНК, выделенной из
нетранс-формированной ткани. Для изучения организации встроенной Т-ДНК на
фильтр следует нанести и остальную ДНК из агробактерий, содержащую
плазмиды pGV3850 и pGV3850:: 1103. Такой препарат ДНК, естественно,
должен быть обработан теми же рестриктазами, что и ДНК растения (?coRI
или Hindlll}. ДНК pGV3850 необходима для определения положения не-
встроившихся рестрикционных фрагментов плазмиды, которые содержат левую и
правую границы (Hindlll: 10 и Hindlll: 23 соответственно). ДНК pGV3850::
1103 позволяет получить ту же информацию, а кроме того, выявить положение
невстроив-шегося гена nos-npt-II (рис. 6.4). Для дальнейшего анализа
целесообразно нанести на фильтр в качестве маркера радиоактивно меченные
фрагменты ДНК фага К, обработанной Hindlll.
6.2.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
Все необходимое для обработки ДНК рестриктазами (разд.
5.2), электрофореза в агарозном геле (разд. 5.3) и блоттинг-
гибридизации по Саузерну (разд. 5.4 и 5.6).
Растворы и препараты
Растворы для рестрикции ДНК, как указано в разд. 5.2, и,
кроме того:
- Препараты ДНК из трансформированных тканей растений (например,
моркови, разд. 2.10).
- Плазмидная ДНК, содержащая изучаемые гены, для приготовления исходных
растворов ДНК, предназначенных для определения копийности перенесенной
ДНК (например, pNCAT4a>).
- Тотальная ДНК штамма агробактерий, использованного для трансформации.
Этот препарат применяют в качестве исходного для определения мол. массы
Т-ДНК в трансформированных тканях [например, штамм С58С1 (pGV3850:: ::
1103)].
- Рестриктазы (например, ?coRI и Hindlll).
- Десятикратные буферы для рестриктаз (разд. 5.2).
Анализ организации и экспрессии генов растений
321
Все необходимое для электрофореза в агарозном геле, как указано в разд.
5.3, и, кроме того:
- Одно- и десятикратные препараты исходной ДНК для определения
копийности в случае генома растения, трансформированного геном npt-11
(например, морковьа>).
Все необходимое для блоттинга по Саузерну, как указано в разд. 5.4.
Все необходимое для гибридизации ДНК, как указано в разд.
5.5, и, кроме того:
- Проба, помеченная с помощью олигонуклеотидной затравки (например,
ген npt-П, разд. 5.6).
6.2.3.2. Методика
Обработка ДНК рестриктазами
Детали использования рестриктаз приведены в разд. 5.2. В данном
случае препараты ДНК готовили с помощью СТАВ-буфера (разд. 4.2.3) и
содержание ДНК определяли в реакции с дифениламином (разд. 4.6). Таким
образом, обработку рестриктазами известного количества ДНК можно
проводить достаточно уверенно. Кроме того, в этом случае можно точно
рассчитать копийность в исходных препаратах ДНК. В целом в связи с
большой сложностью организации ДНК растений (по сравнению с ДНК фага К
или pBR322, используемых для проверки активности рестриктаз) и с тем, что
в неочищенных препаратах могут содержаться примеси, снижающие активность
рестриктаз, обычно используют 5-10 единиц фермента на 1 мкг ДНК растений,
а обработку проводят по меньшей мере 2 ч.
1. Смешивают реагенты для рестрикции ДНК:
Рестриктаза ?coRI 2 мкл (25-50 ед.)
Десятикратный буфер для ?coRI 4 мкл
ДНК растения/ДНК агробактерий 5 мкг/100 нг (до 34 мкл) Доводят до 40
