Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
содержащую ген npt-II, готовят, используя плазмиду pNCAT4. Этот вектор
содержит целиком ген npt-II, который может быть вырезан из плазмнды при
совместной обработке Sall/Hindlll. Отделять ген npt-II от ДНК вектора не
требуется, поскольку в качестве пробы для гибридизации используют только
этот рестрикционный фрагмент. Количество необходимой плаз-мидной ДНК
можно рассчитать следующим образом:
Размер pNCAT4 "8,0 т. п. н.
Поскольку 1x10е т. п. н."1 пг ДНК, это
соответствует 8,0хЮ"6пг
Количество для 5Х106 копий (5ХЮ6)Х(8,0)Х
Х(Ю~6) пг=40,0 пг.
Для удобства следует приготовить концентрированный раствор исходной
ДНК: например, 2,0 мкг (2,0x10е пг) плазмиды pNCAT4 обработать SalI и
Hindlll для отделения гена npt-II н затем развести до 1 мл. Теперь в 20
мкл пробы содержится:
20
2,0X10(r)Х ^553=4x104 пг PNCAT4
[4 X 10^
пг "1 -----------------
40,0 пг
J
Для приготовления образца I0X (400 пг) этот раствор разбавляют в 100
раз контрольной ДНК растения в концентрации 5,0 мкг/40 мкл (концентрация
ДНК растения в изучаемых образцах).
Пробу IX можно приготовить из концентрированного раствора либо, что
гораздо удобнее, нз пробы 10Х, опять же разбавляя ее контрольной ДНК
растения в соответствующей концентрации.
(r)> Следует принять некоторые меры для ограничения количества ДНК агро-
бактернй, наносимого на гель, чтобы получившийся в итоге фильтр не
оказался слишком "неуравновешенным" в отношении интенсивности конечного
радиоактивного сигнала. Эта проблема возникает вследствие большого
различия в размерах генома бактерии и растения. Поскольку известно, что
Ti-плазмиды обнаруживаются в количестве 1--2 копии на бактериальную
клетку, следует наносить такое количество агробактернй, которое было бы
эквивалентно 1-5 геномам растения. К сожалению, это количество труднее
подбирать для бинарных векторов в связи с тем, что нх копийность в
бактериальной клетке варьирует. В случаях когда копийность неизвестна,
следует предварительно провести пробный блот-тннг, чтобы определить,
какое количество ДНК следует наносить.
6.3. Анализ экспрессии генов методом точечного нозерн-блоттинга
Точечный нозерн-'блоттинг (dot blotting) очень удобен для
количественного определения равновесной (постоянной) кон-
Анализ организации и экспрессии генов растений
325
центрации специфических транскриптов, синтезирующихся на собственных
или перенесенных генах. За последние несколько лет данный метод
зарекомендовал себя особенно удобным для анализа регуляторных
последовательностей, находящихся на 5'-конце гена. РНК выделяют из
соответствующих тканей растений, выращенных в определенных условиях.
Несколько разведений препаратов тотальной или ро1у(А)+-РН1\ наносят на
нитроцеллюлозу в виде капель одинакового размера, а рядом наносят капли,
содержащие определенные- разведения контрольной РНК либо ДНК,
клонированного гена, чью экспрессию необходимо изучить. Затем фильтр
гибридизуют так же, как и в случае блоттинг-гибридизации по Саузерну (гл.
5), радиоав-тографируют и определяют содержание определенных транс-
криптов в каждой капле ДНК относительно друг друга, а также сравнивают с
контрольными образцами нуклеиновых кислот.
Метод используют в различных случаях.
- Если перенесенный ген совершенно новый для определенного генома и не
обладает гомологией с нативной ДНК растения (например, ген npt-II для
любого растения [24]).
- Если условия гибридизации подобраны таким образом, что гетерологичные
пробы могут помочь различить транскрипты с нативных и чужеродных генов в
трансгенных растениях (например, ген малой субъединицы РБФК/О [rfecS-E9]
гороха в петунии [9J).
- Если можно получить пробы для гибридизации (синтетические
олигонуклеотиды или кДНК, или геномные субклоны), комплементарные
негомологичным областям нуклеотидной последовательности в нетранслируемой
области транскрипта и помогающие различить нативный н перенесенный ген в
трансгенных растениях или же различить транскрипты, образовавшиеся в
результате экспрессии различных членов мультигенного семейства (например,
экспрессия семейства генов Cab в петунии [12]).
- Если синтетический олигонуклеотид можно использовать для "навешивания
ярлыка", т. е. для введения характерного участка в ген дикого типа. Так
был получен, например, новый транскрипт пататина в картофеле.
В следующем разделе описано использование нозерн-блот-тинга для
изучения равновесной концентрации транскриптов семейства генов Cab в
горохе после различной световой обработки. Нозери-блоттинг можно
использовать для количественного определения РНК, если есть основания
