Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 144

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 138 139 140 141 142 143 < 144 > 145 146 147 148 149 150 .. 184 >> Следующая

мкл дистиллированной НгО.
Ставят в пробирках Эппендорф следующие реакции: Пробирка 1 Контроль:
ДНК из нетрансформированной моркови.
Пробирки 2-6 Трансформанты моркови Т2, ТЗ,Т5,T9,Т10. Пробирка 7
Тотальная ДНК A. tumefaciens.
Детали проведения рестрикции ДНК агробактерий см. также в разд. 1.12б>.
2. Тщательно перемешивают, собирают реакционную смесь на дне пробирки с
помощью кратковременного центрифугирования и обрабатывают ДНК при 37°С
(минимальное время обработки - 2 ч; максимальное - в течение ночи).
322
Глава 6
Таблица 6.1. Порядок иаиесения образцов ДНК иа гель для электрофореза
Дорожка Образец Объем, шел
1 ДНК фага X, обработанная HindUl, маркер 20
2 Тотальная ДНК pGV3850:: 1103 40
3 Исходный образец, IXnpt-ll 20
4 ДНК моркови, контроль 40
5 Т2 40
6 ТЗ 40
7 Т5 40
8 T9 40
9 Т10 40
10 Исходный образец, 10xnpt-I\ 20
3. Вынимают пробирки из водяной бани и центрифугируют, чтобы собрать
конденсат с крышки.
4. Добавляют 4 мкл буфера для нанесения на гель. Тщательно перемешивают и
центрифугируют в настольной центрифуге.
Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном
геле
Подробно электрофорез препаратов ДНК, обработанных рестриктазой,
описан в разд. 5.3. В данном примере препараты ДНК нанесены в порядке,
указанном в табл. 6.1.
Перенос по Саузерну, приготовление проб и гибридизация ДНК
Подробно указанные методы описаны в разд. 5.4, 5.5 и 5.6. На рис. 6.5
приведены результаты гибридизации образцов, приготовленных, как на стадии
1 разд. 6.2.3.2. Необходимо отметить следующие важные особенности:
- Радиоактивно меченный ген npt-II гибридизуется с ДНК агробактерий и с
ДНК каждого из трансформированных растений в виде одной полосы одинаковой
подвижности во всех препаратах. С контрольной ДНК моркови данный ген не
гибридизуется. Эти результаты свидетельствуют о том, что устойчивые к
антибиотику растения содержат ген устойчивости к канамицину. Сравнивая
подвижность фрагментов с маркерами (дорожка 1), можно определить, что эта
полоса соответствует 7 т. п. н., и это точно совпадает с размером,
предсказанным исходя из рестрикционной карты pGV3850::
:: 1103 (рис. 6.4).
Анализ организации и экспрессии генов растений
323
- Трансформированные растения моркови, вероятно, содержат от 1 до 8
копий гена npt-II на геном, что можно определить, исходя из сравнения
интенсивности зон гибридизации и исходных препаратов, содержащих IX и 10Х
копий (дорожки 3 и 10 соответственно).
7 i"? 9 ' 10' J
Рис. 6.5. Анализ последовательностей гена npt-II из каллуса моркови,
устойчивого к канамицину, методом блоттинг-гибридизации по Саузерну.
Каллус получен при совместном культивировании в суспензии клеток моркови
и штамма A. tumefaciens С58С1 (pGV3850:: 1103). 5 мкг ДНК, обработанной
?coRI, Фракционировали в агарозном геле, затем перенесли на найлоновый
фильтр Hybond-N и гибридизовали с меченным 32Р фрагментом Sail-Hindlll
гена npt-II, в котором содержалась кодирующая NPT-II область. Дорожка 1 -
маркерная ДНК фага X, обработанная Hindlll-, 2--тотальная ДНК A. tume-
faciens 'штамма С58С1 (pGV3850:: 1103), обработанная ЕсоШ- На дорожки 3 и
10 нанесены соответственно исходные образцы 1х и 10Х для определения
копийности гена npt-II (фрагмент Hindlll-Sall). Дорожки 4-9 содержат
соответственно контрольную ДНК моркови и ДНК из трансформированных
каллусов Т2, ТЗ, Т5, T9 и Т10, устойчивых к канамицину.
Примечания
а) Исходный препарат IX состоит из препарата контрольной ДНК (из
иетрансформированного растительного материала), к которой добавлен
эквивалент одной копии гена на каждый гаплоидный геном растения. Перед
тем как приготовить такой контроль, следует установить ряд параметров:
1) Размер генома организма (в граммах).
2) Концентрацию препарата ДНК, выделенного из этого организма.
3) Размер рекомбинантной плазмиды, содержащей ДНК-пробу.
4) Концентрацию этой плазмиды.
т.п.н. 1 2 3
;4з_:
4 S
324
Глава б
Пример: приготовление препаратов IX и 10Х исходной смеси для гена npt-
II в трансформированном растении моркови.
Размер гаплоидного генома моркови 1,0 пг=10-
12г
Количество ДНК, нанесенной на гель (см. табл. 6.1) 5,0 мкг=5ХЮ_6
г
5ХЮ"6
Число нанесенных гаплоидных геномов моркови Ю-'Ё----
=5X10(r)
Следовательно, для исходного разведения IX требуется 5Х106 копий
фрагмента ДНК-пробы.
Исходную ДНК для растений, трансформированных pGV3850:: 1103,
Предыдущая << 1 .. 138 139 140 141 142 143 < 144 > 145 146 147 148 149 150 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed