Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Такие плазмиды часто представляют собой просто делеционные мутанты
октопиновых или нопалиновых Ti-плазмид
1 * -------------------------> nos
1 т.П.Н. pBR322
PGV3850
Гомологическая
рекомбинация
Н LB НЕ Н I Е В Н В RB
Н
I Г
ГиЬ
¦ I ^ p
1 т.П.Н. Ap Ap
PGV3860/1103
Рис. 1.4. Структура и использование коинтегративного вектора pGV3850.
Карты, показывающие структуры вектора для трансформации растений pGV3850
¦и промежуточного вектора pGV1103, и возможный результат образования
коиитегранта pGV1103 с pGV3850. LB, RB - левая и правая границы, P,los -
промотор геиа нопалинсинтазы, npt-II - кодирующая последовательность нео-
мицин-фосфотрансферазы II из Тп5, осА - сигнал иолиаденилироваиия гена
октопинсиитазы; точ:ками обозначены области (происходящие из
последовательности pBR322) гомологии между вектором для трансформации
растений и промежуточным вектором, Е - ?coRI, Н - Hindlll и В-ВатШ -
сайты узнаваиия соответствующими рестриктазами, nos - ген нопалинсинтазы,
ApR и KmR - геиы резистентности к ампициллину и каиамицину.
дикого типа (табл. 1.2). Перенос чужеродной ДНК из клонирующего вектора в
растительную клетку может опосредоваться гя'г-областью, функционирующей в
гране-положении.
Широко используемый бинарный вектор pBin 19 получен на основе
репликона pRK252 с широким кругом хозяев (рис. 1.5, Л). Поэтому он
способен реплицироваться как в Е. coli, так и в агробактериях, что
позволяет осуществить инсерцию чужеродной ДНК в вектор с последующим
скринингом в клетках Е. coli
Агробактериальные трансформирующие векторы растений_____________25
Eco RI
Hind 111
Е. 'cot!
О
PRK2013
О с?
^ - ¦ ----
A. tumefaciens
7т^
/LBA4404y
Рис. 1.5. Структура и использование бинарного вектора pBin!9.
А. Карта бинарного вектора pBinl9. LB, RB - левая и правая границы, lac -
а-комплементариая область lac опероиа, Рп03 - промотор гена
иопалиисиитазы, npt-II - кодирующая последовательность
иеомицинфосфотрансферазы II из Тп5, поА - сайт полиаде|Нилироваиия гена
иопалиисиитазы; точками обозначены последовательности плазмиды pRK252,
содержащие начало репликации из плазмиды RK2 с широким кругом хозяев.
Б. Мобилизация pBin]9 в A. tumefaciens LBA4404 с помощью плазмиды-помощ-
иика pRK2013 и последующая элиминация хелпериой плазмиды в агробактериях.
26
Глава 1
до переноса всей конструкции в агробактерии. Вектор содержит маркер
устойчивости к канамицину (Km1:) для прямой селекции в бактериях, а также
последовательности границ Т-ДНК, фланкирующие доминантный селективный
маркер для использования в клетках растений (ген устойчивости к
канамицину, фланкированный яох-промотором и сигналом полиаденилирования)
и множественный сайт для клонирования в области а-комплементации р-
галактозидазы. Скрининг рекомбинантов можно осуществлять в Lac~ штаммах
Е. coli путем а-комплементации в присутствии изопропилтио-р-О-галактозида
(ИПТГ) и 5^бром-4-хлор-3-индо-лил-р-О-галактозида (X-GAL) [24]. Вектор
можно мобилизовать в агробактерии путем конъюгации с помощью плазмиды
pRK2013. Реципиентный штамм Agrobacterium LBA4404 содержит Ti-плазмиду
(pAL4404), у которой Т-ДНК была делетиро-вана, но сохранена интактная
fir-область. Для селекции транс-конъюгантов, содержащих pBinl9, можно
использовать устойчивость к канамицину и рифампицину.
Примеры векторных систем, имеющих гранс-действующие m'r-гены,
представлены в табл. 1.2. Эти бинарные векторы варьируют по размерам,
стабильности репликации в агробактериях, наличию рестрикционных сайтов
для встраивания чужеродной ДНК, возможности использования X-GAL для
скрининга рекомбинантных плазмид путем а-комплементации, наличию
маркерных генов для селекции трансформированных растений и селекции
трансконъюгантов. Известно, что большинство этих плазмид совместимо с
различными игг-плазмидами-помощниками A. tumefaciens, а многие совместимы
и с Ri-плазмидами.
1.1.8. Векторы для трансформации растений с помощью
A. rhizogenes
Первоначально такие векторы использовались для трансформации в тех
случаях, когда трудно регенерировать целые растения из отдельных клеток.
Растения многих видов могут регенерировать из культуры корней,
индуцированных A. rhizogenes, путем соматического эмбриогенеза или
органогенеза. Механизм, с помощью которого подавляется фенотип косматых
корней (что обусловливает возможность морфогенеза побегов), до конца не
выяснен. Регенерированные из косматых корней растения часто
морфологически изменены, характеризуются складчатостью листьев,
