Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
клонирования генов высших растений с помощью генетической комплементации
[47].
Векторы "маркирования генов" вблизи правой границы Т-ДНК содержат
лишенные промотора селектируемые маркерные гены. Случайная интеграция
такой Т-ДНК рядом с геномной последовательностью, обладающей промоторной
активностью, восстанавливает активность маркерного гена, что позволяет
селектировать трансформанты данного типа на среде, содержащей
антибиотики. Поэтому такие векторы полезны для клонирования
последовательностей, обладающих промоторной активностью [5].
1.1.10. Выбор Ti-плазмидной векторной системы агробактерий
Выбор векторной системы для конкретного эксперимента по трансформации
зависит от многих факторов, среди которых далеко не последними можно
считать цель эксперимента и используемые виды растений. Из предыдущего
раздела очевидно, что
30
Г лава 1
векторы могут быть предназначены для осуществления специальных функций.
Однако важно осознавать, что ни одна из векторных систем не может быть
использована во всех случаях; это прежде всего относится к кругу хозяев,
поскольку многие векторы первоначально тестировали только в системах
трансформации модельных растений, чаще всего табака или петунии и
различных видов пасленовых. Рассмотрим некоторые свойства обычных
трансформирующих векторов, которые необходимо учитывать при разработке
системы генетической трансформации новых растений.
1.1.10.1. Векторы ({"с-типа по сравнению с векторами граяс-типа,
конъюгация и стабильность плазмид
Промежуточные векторные компоненты коинтегративных векторов (""с-типа)
и современные бинарные векторы сходны по размерам (6,5-28 т. п.н.) и
обычно легко выделяются из Е. coli. Таким образом, все манипуляции с
рекомбинантными ДНК без каких-либо проблем можно осуществлять в Е. coli.
Мобилизация таких векторов в агробактерии обычно не составляет труда, но
существуют различия в частоте мобилизации в зависимости от выбора вектора
[36]. Системы конъюгационно-го переноса клонирующих векторов между Е.
coli и агробактериями специфичны для данного трансформирующего вектора -
растений, подробно они обсуждаются в разделе 1.10. Следует также
отметить, что помимо эффективности мобилизации частота селекции
трансконъюгаитов в агробактериях гораздо выше для бинарных векторов,
поскольку отпадает необходимость образования коинтегрантов (рис. 1.3).
Кроме того, бинарный вектор легко перенести путем конъюгации и
стабилизировать в любом новом штамме агробактерий, если возникает
необходимость получить комбинацию вектора с различными игг-системами,
новым хромосомным окружением или другими детерминантами бактериальной
продукции фитогормонов. Чтобы достигнуть того же результата с
коинтегративными векторами, часто приходится заново конструировать
рецепторную плазмиду-помощник atr-функций.
К настоящему времени наиболее удобные (в отношении размера репликона)
функции репликации в широком круге хозяев, позволяющие бинарным векторам
стабильно сохраняться при наличии селекции в агробактериях, происходят из
плазмиды pRK252. Репликон рКТ240 также не слишком велик, функционирует кш
в агробактериях, так ив Е. coli и, как утверждают, стабилен в отсутствие
селекции [40].
Часто в агробактериях обнаруживается несколько копий бинарных
векторов, тогда как векторы цис-типа обычно присут-
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 31
сгвуют в одной копии. Влияние этих различий на эффективность трансфор-
мации, копийность вставок Т-ДНК или организацию Т-ДНК в
трансформированных растительных клетках оконча-тельно не доказано.
1.1.10.2. Wr-гены, повторы длиной 25 п. и. и круг растений-хозяев
Уже довольно давно известно, что некоторые штаммы агробактерий дикого
типа более вирулентны по отношению к одним видам двудольных растений, чем
к другим (см., например, L12]). Полагают, что этот эффект практически не
имеет отношения к онкогенности используемой Т-ДНК, а наоборот, зависит от
эффективности конкретных глг-генов в процессе переноса Т-ДНК, функции
участков Ti-плазмиды вне глг-областей и районов Т-ДНК, которые усиливают
процесс переноса, а также от собственной бактериальной хромосомы
используемого штамма агробактерий. Это ограничение круга хозяев очевидно
и в том случае, когда для переноса Т-ДНК неонкогенных векторов
используются ш'г-гены одной и той же Ti-плазмиды дикого типа.
Vir -системы
Насколько известно, все системы гя'г-генов широкого круга хозяев
способны узнавать повторы длиной 25 п. н., фланкирующие области Т-ДНК Ti-
и Ri-плазмид, и обеспечивать вырезание Т-ДНК и ее перенос в геном
растения [30, 34, 48]. Однако, хотя системы вирулентности различных
штаммов агробактерий проявляют общие функции, они не идентичны, и
некоторые из них могут обеспечивать более эффективную трансформацию одних
видов растений, чем других [12, 20]. В табл. 1.1 и 1.2 приведены общие
угг-системы, используемые в сочетании с неонкогенными трансформирующими
