Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Природная способность агробактерий переносить определенные
последовательности ДНК в растительный геном была использована при
конструировании ряда векторов для трансформации растений с учетом
различных особенностей процесса трансформации под действием агробактерий.
В начале 80-х годов многие группы исследователей модифицировали Ti-
плазмиды таким образом, чтобы удалить все онкогены Т-ДНК. При этом было
обнаружено, что кодируемые Ti-плазмидой онкогены не участвуют ни в
переносе Т-ДНК в растительную клетку, ни в ее интеграции с ядерной ДНК-
Следовательно, эти гены можно заменить, встроив вместо них чужеродную
ДНК. При этом плазмида теряет онкогенные свойства. Следует, однако,
отметить, что nos- или ocs-гены представляют собой удобные маркеры для
трансформации, поскольку ферментативную активность их продуктов легко
тестировать. До настоящего времени не сообщалось
о возможных ограничениях размера вставки. Важную роль в данной области
исследований сыграло и открытие того факта, что продукты шг-генов
способны функционировать в транс-положении. Наконец, неонкогенные Т-ДНК,
присутствующие в регенерированных целых растениях, передаются в потомстве
согласно законам Менделя.
18
Глава 1
1.1.6. Основные компоненты неонкогенных Ti-плазмидных векторов
Принимая во внимание характер переноса генов, осуществляемого
агробактериями, любую клонированную чужеродную ДНК можно перенести в
геном клетки двудольного растения. Чужеродная ДНК, которую собираются
перенести, должна быть фланкирована концевыми последовательностями Т-ДНК
и стабильно поддерживаться в штамме агробактерии, несущем полный набор w-
генов в цис- либо транс-положении (т. е. локализующихся на отдельной
плазмиде - помощнике вирулентности или "хелперной" плазмиде). Здесь
следует отметить, что были описаны и хромосомные гены агробактерий,
связанные с вирулентностью. Считается, что их продукты участвуют в
узнавании бактерией поверхностных компонентов растительной клетки и
последующем прикреплении.
Потеря онкогенных свойств означает, что в этом случае
трансформированные ткани невозможно идентифицировать как неопластические
выросты, клетки которых легко селектировать по их способности к росту на
среде, не содержащей фитогормонов. Для разрешения проблемы идентификации
трансформированных клеток между повторами длиной 25 п. н. встраивают
бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, помещенные под контроль
промоторов Т-ДНК и снабженные сигналами полиадени-лирования. Такие
химерные гены устойчивости к антибиотикам эффективно экспрессируются в
растительных клетках как доминантные признаки в любом генетическом
окружении. Удобно, чтобы маркерные гены были тесно сцеплены с чужеродной
ДНК по двум причинам. Во-первых, это позволяет осуществлять прямую
селекцию трансформированной ткани растения, чтобы убедиться в переносе
чужеродной ДНК. И во-вторых, это гарантирует, что фланкирующая чужеродная
ДНК в конкретном трансформированном клоне, полученном в результате
селекции, не была встроена в нетранскр'ибируемую область генома.
1.1.7. Неонкогенные векторы общего назначения
на основе Ti-плазмид, используемые для трансформации растений
Для переноса чужеродной ДНК в растения использовались как A.
tumefaciens, так и A. rhizogenes. Относительно генетических функций Ri-
плазмид известно гораздо меньше, и поэтому векторы для трансформации,
сконструированные на их основе, будут обсуждаться отдельно (разд. 1.1.8).
На основе Ti-плазмид разработаны многочисленные трансформирующие векторы
общего назначения (примеры приведены в табл. 1.1 и 1.2). Эти
Агробактериальные трансформирующие векторы растений
19
Б
Рис. 1.3. Схематическая диаграмма обобщенных коннтегративной (Л) и
бинарной (Б) векторных систем. VIR -область вирулентности, НОМ-области
гомологии, в пределах которых может происходить рекомбинация, приводящая
к образованию коинтегрантов. LB и RB- левая и правая границы (в
промежуточном векторе могут присутствовать как LB, так и RB либо обе
границы, см. текст), MCS - множественный (полилинкерный) сайт для
клонирования, РТМ-маркер для трансформации растений, RES - маркер
устойчивости к антибиотику для селекиии на присутствие
последовательностей вектора в бактерии-хозяине, oriT - начало переноса и
bom-сайт для мобилизации векторов При конъюгации, ColEl-начало репликации
из плазмиды ColEl, RK2 - начало репликации из плазмиды RK2 с широким
кругом хозяев.
векторы не содержат каких-либо онкогенных последовательностей, и,
следовательно, после переноса с их помощью ДНК в ядро растительной клетки
нормальный рост растения не нарушается. Используемые обычно неонкогенные
векторы можно разделить на два типа - цис или транс, в зависимости от
того, находится ли область Т-ДНК, фланкированная прямыми повторами длиной
25 п. н., на том же репликоне, что и vir-гены, или на отдельной плазмиде
(рис. 1.3). В первом случае (цис-дейст-вующие ш'г-гены) вектор часто
именуют коннтегративным, а во втором случае, при использовании транс-
