Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
векторами растений. Вообще в большинстве бинарных векторных систем
используют плазмиду октопинового типа (pTiAch5), у которой делегированы
Т-ДНК и повторы длиной 25 п. н. (pAL4404). Рецепторные коинтегративные
плазмиды pTiB6S3-SE и pGV2260 получены из Ti-плазмиды октопинового типа
pTi86S3, а плазмида нопалинового типа pTiC58 послужила основой для
конструирования pGV3850. Таким образом, трудности получения
трансформантов при использовании бинарных векторов в LBA4404 во многих
случаях могут отражать ограничения глг-функций pAL4404.
Недавно было показано, что из растительных тканей можно регенерировать
нормальные трансформированные побеги, утратившие онкогены Т-ДНК, если для
обеспечения хелперных vir-функций использовать штаммы A. tumefaciens [20]
и A. rhizogenes [46, 53] дикого типа в сочетании с неонкогенными
бинарными векторами, несущими доминантные маркерные гены. Из
32
Глава 1
этих данных следует, что Т-ДНК бинарного вектора может переноситься в
некоторые клетки независимо от Т-ДНК Ri- или Ti-плазмиды. Недавно была
описана супервирулентная Ti-плаз-мида (pTiBo542), обнаруженная в штамме
A. tumefaciens дикого типа А281 [35]. По сравнению с другими штаммами A.
tumefaciens А281 индуцирует большие, быстро развивающиеся опухоли у более
широкого круга растений-хозяев. При использовании этой плазмиды дикого
типа в качестве uir-помощника эффективность трансформации по сравнению с
другими utr-системами возрастает по крайней мере втрое [2,4].
Использование "супер-вирулентных" Ti- и Ri-плазмид дикого типа в будущем
может сыграть важную роль в разработке систем трансформации культурных
растений.
Усилители переноса Т-ДНК
Сообщалось, что в плазмиде дикого типа pTiA6NC особая
последовательность, примыкающая к повтору длиной 25 п. н. на правом конце
(получившая название "усилитель переноса" от англ. overdrive), усиливает
перенос Т-ДНК [43]. В аналогичных районах нопалиновых Ti- (pTiT37) и Ri-
плазмид (pRiA4) тоже были найдены последовательности ДНК с почти
идентичной центральной частью (TGTTTGTT). Таким образом, важно выяснить,
соседствует ли подобная последовательность с правой границей Т-ДНК в
используемом векторе.
Роль собственной хромосомы агробактерий
Следует принимать во внимание и генетический фон хозяйского штамма
агробактерий, поскольку в бактериальной хромосоме локализованы некоторые
шг-функции, связанные главным образом с узнаванием поверхности
растительной клетки и прикреплением к ней [19, 25]. Штаммы агробактерий
различаются по скорости роста, продукции полисахаридов и общей
токсичности для растительных клеток; все это может влиять на
эффективность трансформации in vitro.
Продукция фитогормонов агробактериями
Уже несколько лет известно, что штаммы агробактерий сек-ретируют как
ауксины (индолилуксусную кислоту, ИУК), так и цитокинины (транс-зеатин) и
что подобная активность может создавать локальное гормональное окружение,
оказывающее физиологическое влияние на клетки растения в отношении их
компетентности для трансформации, скорости роста трансформированных
клеток и проявлений морфогенеза. Например, в нопалиновых штаммах
обнаружен локус (tzs), расположенный с внешней стороны рядом с границей
vir-oбласти, который кодирует фермент, отвечающий за конститутивную
продукцию бактерией
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 33
транс-зеатина [7]. Недавно было показано, что инокуляция он-когенного
нопалинового штамма дикого типа С58 (pTiC58) усиливает регенерацию
эксплантатов листа Populis по сравнению с контролем. Подобный эффект не
обнаруживается при инокуляции в те же эксплантаты октопинового штамма
LBA4404, несущего хромосому Ach5 [20].
Таким образом, при работе с отдельными видами растений или даже
сортами одного и того же вида следует иметь в виду, что трансформирующий
вектор может быть более эффективен, если он направляется определенной
ш'г-областью в сочетании с определенным хромосомным окружением.
Оптимальные комбинации гпг-систем, функций усилителя вирулентности и
хромосомного фона, которые максимально увеличивают эффективность переноса
Т-ДНК, можно определить только эмпирически.
1.1.10.3. Селектируемые/скринируемые маркерные гены для идентификации
трансформированных клеток растений
Селективные маркерные гены
Следует учитывать две основные особенности маркерных генов. Во-
первых, их структуру (нуклеотидную последовательность), которая
определяет такие факторы, как регуляция транскрипции (конститутивная
экспрессия или включение под действием определенных внешних условий или
стадии развития), скорость транскрипции, стабильность транскрипта и
эффективность трансляции. Во-вторых, активность продукта данного гена,
который, очевидно, отвечает за доминантную экспрессию подходящего
селективного фенотипа. В большинстве обычных векторов трансформации в
качестве селективных маркеров используют прокариотические ферменты
устойчивости к антибиотикам, которые были адаптированы с помощью генно-
