Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
регуляции метаболических процессов, вовлеченных в синтез фитогормонов,
что и приводит к онкогенному фенотипу. Следовательно, эти гены (tmsl,
tms2 и tmr) можно отнести к так называемым опс-генам (подробнее см. разд.
2.1). Однако следует отметить, что входящие в состав Т-ДНК гены не
участвуют в переносе Т-ДНК в растительные клетки и не влияют на ее
стабильность в геноме растений.
1.1.3. Ri-плазмиды
Agrobacterium rhizogenes
Индукция заболевания косматого корня бактериями A. rhizogenes
аналогична трансформирующему действию A. tumefaciens. Под контролем шг-
области две отдельные области Т-ДНК плазмиды переносятся в растительный
геном [16, 31]. Они получили название Tl (Т-левая Т-ДНК) и Tr (Т-правая
Т-ДНК). Tr Т-ДНК содержит гены, кодирующие опины (маннопин или агропин),
и соответственно этому штаммы характеризуют по их специфическим опиновым
генам [16]. TR Т-ДНК, кроме того, содержит два гена, кодирующие ауксин.
Эти гены в значитель-
АгроОактериальные трансформирующие векторы растений 15
ной степени гомологичны ауксиновым генам A. tumefaciens и способны, как
было показано, комплементировать мутации аук-синовых генов в штаммах A.
tumefaciens L42]. Tl Т-ДНК, напротив, не имеет гомологии с Т-ДНК A.
tumefaciens [31]. Tl Т-ДНК A. rhizogenes полностью секвенирована; она
содержит по крайней мере 11 открытых рамок считывания, сходных с
эукариотическими, которые снабжены необходимыми элементами промоторов и
сигналами полиаденилирования (последние должны функционировать после
переноса в растительный геном, [48]). Эти гены не имеют гомологии ни с
одним из известных генов, в них не обнаруживается и заметной гомологии с
Т-ДНК (октопинового типа) из A. tumefaciens. Для поддержания фенотипа
косматого корня нет абсолютной необходимости в TR Т-ДНК, однако штаммы
Agrobacterium, несущие как Tl, так и TR Т-ДНК, более вирулентны и
заражают большее число видов растений, чем штаммы, несущие только одну Т-
ДНК [57].
1.1.4. Механизм переноса Т-ДНК
Области Т-ДНК как у A. tumefaciens, так и у Л. rhizogenes фланкированы
прямыми повторами длиной 25 пар нуклеотидов (п. н.) (см. рис. 1.1), и
концы Т-ДНК, интегрированной в растительный геном, обнаруживаются вблизи
этих последовательностей. Обобщенную последовательность границы Т-ДНК
можно представить следующим образом:
GGCAGGATATTCAGTTCTAAfT.
Большинство исследований механизма переноса Т-ДНК из агробактерий в
клетку растения проводилось на A. tumefaciens. Удаление правой границы в
Ti-плазмиде нопалинового типа нарушает образование опухоли, однако, когда
олигонуклеотид длиной 25 п. н., гомологичный правой границе, встраивают в
правильной ориентации в Ti-плазмиду, утратившую правую границу,
опухолеобразование восстанавливается [58]. Последнее предполагает, что
повторяющиеся последовательности длиною 25 п. н. являются как полярными,
так и цис-действующими.
Контакт агробактерий с соединениями, выделяющимися из поврежденной
ткани растения, приводит к транскрипции vir-области Ti-плазмиды (рис.
1.2). Одно из химических веществ, высокоактивных в этом отношении, было
идентифицировано как ацетосирингон [49]. Гены vir А и virG
экспрессируются в вегетативно растущих бактериях, хотя virG
транскрибируется на низком уровне. Считается, что при действии экссудата
поврежденных растительных клеток или чистого ацетосирингона на
агробактерии.продукт гена virA (возможно, ассоциированный с мембраной)
узнает и взаимодействует с ацетосирингоном, и передает
16
Глава I
Клетка двудольного растения, отвечающая на повреждение
Прикрепление агробактерии к поверхности растительной клетки
Активированная ацетосирингоном
клетка агробактерии
Рис. 1.2. Схема взаимодействий агробактерий с клетками растения н
механизм переноса Т-ДНК (Ас-ацетосирингои).
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 17
этот внеклеточный сигнал внутрь клетки, что приводит к акти-вациипродукта
гена virG. Измененный белок virG затем активирует остальные гены
вирулентности (virB, С, D и Е), а также повышает уровень транскрипции
самого локуса virG.
Индукция utr-генов сопровождается появлением одноцепочечных разрывов
внутри пограничных последовательностей длиною 25 п. н., фланкирующих Т-
ДНК [1, 50], и одноцепочечных линейных молекул, которые соответствуют Т-
ДНК (рис. 1.2). Предполагают, что соответствующей эндонуклеазной
активностью обладают продукты оперона virD [60]. С помощью пока еще
неизвестного механизма, который, возможно, аналогичен бактериальной
конъюгации, T-ДНК. переносится в клетку растения и стабильно встраивается
в ядерную ДНК [50]. Вероятно, что в этом процессе участвуют белки,
кодируемые опероном virE [59]. Модель, описывающая ранние молекулярные
события в процессе взаимодействия между растением и агробактериями во
время образования корончатых галлов [37], представлена на рис. 1.2.
1.1.5. Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации
