Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
плагиотропной корневой системой, низкорослостью и низкой фертильностью
[52].
1.1.8.1. Д"с-векторы
Сконструирован промежуточный вектор, который позволяет проводить
необходимые манипуляции в Е. coli и содержит область Т-ДНК из Ri-
плазмиды. Введение этого вектора в клетки
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 27
A. rhizogenes, несущие нормальную Ri-плазмиду, приводит к стабилизации
последовательностей промежуточного вектора в результате
внутримолекулярной гомологичной рекомбинации в Ri-плазмиде [32].
1.1.8.2. Транс-векторы
"Разоруженные" бинарные векторы, полученные на основе A. tumefaciens
[8, 54], можно вводить в штаммы A. rhizogenes, где они будут стабильно
реплицироваться в селективных условиях. Последующая инфекция растения
штаммом A. rhizogenes, несущим бинарный вектор, вызовет перенос в геном
растения не только Т-ДНК A. rhizogenes, но также и Т-ДНК бинарного
вектора [46, 48]. Переносимые в растительный геном гены локализуются
между последовательностями границ Т-ДНК бинарного вектора, которые
функционируют в гране-положении после индукции игг-области резидентной
Ri-плазмиды дикого типа [48, 51, 53]. Это может быть обусловлено высокой
степенью гомологии на уровне ДНК между областями вирулентности Л.
tumefaciens и A. rhizogenes [31].
Недавно были индуцированы косматые корни у томата и огурца с помощью
штамма A. rhizogenes дикого типа, содержащего бинарный вектор с
селективным маркером Кшг. Среди ре-генерантов из этих устойчивых к
канамицину линий косматого корня проводили скрининг растений с нормальным
фенотипом. Было найдено несколько таких растений, которые утратили Т-ДНК
A. rhizogenes, но сохранили Т-ДНК бинарного вектора 146, 53],
предположительно, благодаря независимому переносу отдельных Т-ДНК- Если
бы этот процесс можно было распространить на большее число культурных
растений, то A. rhizogenes была бы весьма перспективна в качестве вектора
трансформации.
1.1.9. Использование специальных трансформирующих векторов на основе
Ti-плазмид
Приведенный в табл. 1.1 и 1.2 перечень векторов ни в коей мере не
является исчерпывающим, однако он дает представление о диапазоне свойств
векторов для трансформации общего типа. В то же время существуют
разнообразные векторы трансформации растений, предназначенные для
специальных целей (рис. 1.6).
Векторы экспрессии содержат сайты для клонирования, позволяющие легко
использовать промоторы вектора, которые работают в растительных клетках и
обеспечивают транскрипцию ^клонированных генов. Такие векторы
используются для изуче-
28
Глава I
, Сигнал присоединения ро!у (А) nos-'гема
ген устойчивости к антибиотику, расположенный вблизи правой границы
V
Г
Col Е1
Селективный маркерный ген для растений
Бактериальный селективный маркерный ген
Точка начала репликации плазмиды с широким кругом
хозяев
cos -сайт
35S- промотор ВМЦК Множественный сайт для
кпонирования Повтор длиной 25 п.н.
Точка начала репликации плазмиды Col Е1
Рнс. 1.6, Схематическая диаграмма специализированных векторов
трансформации растений на основе Ti-плазмид. ВМЦК - вирус мозаики цветной
капусты.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 29
ния продуктов считывания эукариотических кДНК, бактериальных генов или
мутантных кодирующих последовательностей -высших растений. К таким
векторам относятся рАР2034 [56], pMON316 [44], рАЮСЗ [9].
Аналогично этому были разработаны векторы, содержащие беспромоторные
индикаторные гены с множественным линкером в 5'-области для встраивания
промоторных последовательностей; в качестве примера можно привести вектор
для тестирования промоторов pGA482, который был описан в 1986 г. [3].
Космидные векторы содержат вне области Т-ДНК cos-сайт фага %, что
обеспечивает упаковку растительных трансформирующих 'векторов, несущих
большие вставки ДНК. Векторы этого типа включают pAGS127 [54] и многие
векторы из семейства pCVOOl-ЗП, описанного Кончем и Шеллом [36].
Векторы спасения плазмид и космид содержат между границами Т-ДНК
бактериальные гены устойчивости к антибиотикам и/или область начала
репликации Е. coli или cos-сайт X; они облегчают клонирование
фланкирующих последовательностей в местах интеграции Т-ДНК с помощью
методов спасения плазмид или космид. К таким векторам можно отнести
pGV3850 [61], pEND4K [34] и pGA471 [4]; они удобны для клонирования генов
с помощью подхода, основанного на инсерционном мутагенезе, и для изучения
влияния положения генов в геноме на их экспрессию. К другому типу
векторов этой категории относится рС22, который можно использовать для
конструирования геномных библиотек в Е. coli с целью переноса в
агробактерии, а затем в большую популяцию растительных клеток. В
настоящее время предприняты попытки использовать этот вектор для
