Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
областей. Области наиболее сильной гомологии между двумя плазмидами имеют
черный цвет. Флажками обозначены прямые повторы длиной 25 п. н.; CON -
области, кодирующие функции конъюгации; ORI - область репликации и начала
репликации (ориджин); VIR - область вирулентности; Т-ДНК, Tl и Ти -
области, содержащие Т-ДНК (от англ. Transferred). Б. Карты Т-областей
плазмид нопалинового и октопинового типов; показаны основные
функциональные домены, области гомологии и транскрипты. Продукты
транскрипции, идентифицированные к моменту написания книги, обозначены: 3
(nos) - нопалинсинтаза, 3 (ocs) - октопинсинтаза, acs - агроцино-
пинсинтаза, 1 (tms 1)-триптофанмонооксигеназа, 2 (tms2)-индол-3-ацет-
амидгидролаза, 4 (tmr) -диметилаллил фМА)-трансфераза, agr - три
транскрипта, необходимые для синтеза агропина.
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 13
1.1.2. Ti-плазмиды
Agrobacterium tumefaciens
Ti -плазмиды (рис. 1.1, Л), обнаруженные во всех вирулентных штаммах
A. tumefaciens, имеют размеры около 200-250 тыс. пар нуклеотидов (т. п.
н.) и стабильно сохраняются в агробактериях при температуре ниже 30°С.
Согласно данным ДНК-ДНК-гибридизации и гетеродуплексного картирования, в
Ti-плазми-дах различных штаммов агробактерий имеются четыре области
гомологии. Генетический анализ показал, что две области, Т-ДНК (от англ.
Transferred) и utr-область (от англ. virulence), связаны с
опухолеобразованием, тогда как две другие вовлечены в конъюгационный
перенос и репликацию плазмид в клетках агробактерий.
В процессе опухолеобразования определенная последовательность Ti-
плазмиды, Т-ДНК, переносится в клетки растения и встраивается в их
ядерный геном. Т-ДНК стабильна в растительном геноме. Как показала
гибридизация опухолевой ДНК со специфичным Ti-плазмидным зондом,
содержащаяся в растительных клетках Т-ДНК колинеарна исходной Т-ДНК Ti-
плазмиды агробактерий, что свидетельствует об отсутствии заметных
перестроек в последовательности плазмидной ДНК в процессе генерации
опухоли. В растительную ДНК может включаться одна или более копий Т-ДНК,
и хотя множественные копии Т-ДНК могут образовывать тандемные повторы,
они могут быть разбросаны по геному и сцеплены с различными районами
растительной ДНК. Место встраивания Т-ДНК в растительную ДНК, по-
видимому, случайно. В различных Ti-плазмидах найдены области,
гомологичные Т-ДНК (рис. 1.1, Б). В обычно используемых нопалиновых
штаммах A. tumefaciens размер области Т-ДНК составляет около 24 т. п. н.
В некоторых корончатых галлах октопинового типа выявлены два несмежных
сегмента Tl и TR. Последовательность TL (14 т. п. н.) обнаружена во всех
линиях трансформированных клеток и функционально эквивалентна Т-ДНК
нопалиновых клеточных линий. TR (7 т. п. н.), которая происходит из
района Ti-плазмиды, локализующегося правее Tl-ДНК, обнаружена в некоторых
опухолевых линиях, причем число ее копий может отличаться от такового для
Tl-Последнее обстоятельство указывает на независимость процессов переноса
TL и Tr.
В опухолевых клетках Т-ДНК транскрибируется (рис. 1.1, Б) с
образованием различных полиаденилированных мРНК. Количество
накапливающихся в клетках гранскриптов Т-ДНК относительно невелико по
сравнению с другими растительными мРНК, а относительное их содержание
может быть различным. Определение нуклеотидной последовательности Т-ДНК
нопали-
14
Глава 1
нового типа позволило идентифицировать 13 протяженных открытых рамок
считывания, тогда как в октопиновых Tl- и Tr-ДНК обнаружено
соответственно 8 и 6 протяженных открытых рамок. Транскрипты правой части
нопалиновой Т-ДНК функционально эквивалентны транскриптам Tl-ДНК (рис.
1.1, Б). Общая организация генов Т-ДНК и их фланкирующих областей сходна
с таковой эукариотических генов, хотя они не содержат интронов. Для
выяснения функций продуктов, кодируемых отдельными генами Т-ДНК,
использовали методы сравнения нуклеотидных последовательностей,
делеционного и инсерционного мутагенеза, а также супер продукции
соответствующих белков в клетках Е. coli. Один из генов октопиновой Ть-
области (транскрипт 3) кодирует октопинсинтазу (ocs). В нопалиновых Ti-
плаз-мидах гены опинсинтаз включают и гены нопалинсинтазы {nos), и
агроцинопинсинтазы (acs). В октопиновых Ti-плазмидах Tr-o6-ласть кодирует
два белка, ответственных за синтез маннопина, и один - за превращение
маннопина в агропин. Локус tmr (транскрипт 4) кодирует фермент,
участвующий в синтезе ци-токинина; мутации в этом локусе приводят у
некоторых растений к пролиферации корней из ткани корончатых галлов
("rooty" или "корневые" мутанты). Локусы tmsl и tms2 (транскрипты 1 и 2)
определяют нерегулируемый синтез ауксинов, и мутации в любом из них у
многих типов растений обусловливают появление побегов из ткани корончатых
галлов ("shooty" или "побего-вые" мутанты). Таким образом, Т-ДНК содержит
гены (tmsl, tms2 и tmr), продукты которых препятствуют нормальной
