Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
кер
pBin 19') pAL44042> pRK 252 НВ101/С58С1 Km
(10 т. п. и.) (делеционный му (получена из
тант pTiAch5) PRK2)
pAGSl 133> pAL4404 pRK2 НВ101/С58С1 Km
(16 т. п. н.)
pAGS1253> pAL4404 pRK2 НВ101/С58С1 Km, Тс
(17,6 т. п. н.)
pARC84) pRiA47> pRK2 НВ101/А4 Тс, Ар9>
(28 т. п. н.)
Бинарный5) pAL4404 pKT2408) LE392/C58C1 Sm, Gm
(17 т. п. н.)
pGA4696> pTiA6 pTJS75 К802/А136 Тс
(10,8 т. п. и.) pTiT37 (получена из
pTiBo542 RK2)
') [8]; 2) [30]; 3) [54]; *) [48];
7) pARC8 может также функционировать с плазмидами-помощниками A.
tumefaciens. 9) Ген Арг между границами Т-ДНК может быть полезен для
клонирования Т-ДНК
рованной Ti-плазмиды. Таким образом, в штаммах A. tumefaciens,
содержащих эти конструкции, во время трансформации Т-ДНК переносится в
геном растения в результате действия vir-области в положении цис.
В качестве более детального примера можно привести pGV3850 [61] -
цис-вектор, в котором онкогены Ti-плазмиды нопалинового типа (С58) были
заменены на pBR322 (рис. 1.4). Любую последовательность чужеродной ДНК,
клонированную в pBR322, можно ввести в pGV3850 с помощью двухступенчатого
переноса в агробактерии путем конъюгации и последующей рекомбинации. Для
этого pBR322, содержащую ген, который переносят в растительную клетку, и
маркер, обеспечивающий селекцию в агробактериях (ген устойчивости к
канамицину или стрептомицину/опектиномицину), вводят в штамм Е. coli
(GJ28), несущий две плазмиды-помощника, pGJ28 и pR64drdll. Эти плазмиды
осуществляют хелперные функции по отношению к ColEl, и в результате все
три плазмиды передаются агробакте-
Агробактериальные трансформирующие векторы растений
23
Плазмиды-по Граница T-ДНК Растительный Nos/Ocs Сайты для клони
мощники, селективный рования. Приме
МоЬ/Тга маркер чания
pRK2013 Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II Уникальные сайты
(НВ101) EcoRI, BamHl, Hindlll,
Sstl, Smal, Xbal и Sail
Скрининг иа ИПТГ+
+X-GAL
pRK2013 Rb/Lb nos-npt-II - Clal, BamHl
(НВ101) pTiA6/Ach5
PRK2013 Rb/Lb nos-npt-II --- Clal, BamHl
(НВ101) pTiA6/Ach5
pRK2013 Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II - EcoRI, Hindlll
(НВ101)
pRK2013 Rb/Lb pTiT37 nos-npt-II Nos .EcoRI, Kpnl, Smal,
Xbal,
(mm294) Sal I
PRK2013 Rb/Lb pTiT37 110S-npt-II --- .EcoRI, Hindlll
5> [40]; ") [4].
8) Репликои рКТ240 стабилен в агробактериях без селекции, путем
спасения плазмиды.
риям при конъюгации. Однако pBR322 не способна к репликации в
агробактериях и, следовательно, не будет сохраняться. Тем не менее между
pBR322 и pGV3850 может произойти рекомбинация, которая приведет к
переносу последовательности представляющего интерес гена в Ti-плазмиду.
Селекцию трансконъю-гантов можно осуществить по устойчивости, кодируемой
плазмидой, и устойчивости к рифампицину, которая кодируется хромосомой
апробактерий. Затем с помощью гибридизации по Сау-зерну проводят тонкое
картирование вставки в pGV3850.
1.1.7.2. Граяс-векторы
Транс- или бинарные векторы конструируются на основе плазмид,
содержащих последовательности границ Т-ДНК и способных реплицироваться
как в Е. coli, так и в агробактериях (рис. 1.3, Б). Эти векторы могут
быть устроены таким образом, чтобы последовательности границ фланкировали
множественные
24
Глава 1
сайты для клонирования, позволяющие осуществить инсерцию чужеродной ДНК,
и маркеры, обеспечивающие прямую селекцию трансформированных растительных
клеток. С плазмидами можно манипулировать в Е. coli, а затем переносить
их путем конъюгации в штаммы агробактерий, содержащие Ti-плазмиду,
которая несет шг-область, но не имеет Т-ДНК и повторов длиной 25 п. н.
