Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
воду по крайней мере три раза за 24 ч и: постоянно перемешивая ее на
магнитной мешалке.
7. Измеряют концентрацию раствора ДНК при 260 нм, используя кварцевые
кюветы (1 OD26o = 50 мкг/мл). Если препарат загрязнен, можно промерить
весь спектр поглощения ДНК в интервале от 200 до 300 нм. Чистый препарат
даст острый пик поглощения при 260 нм, а соотношение OD26o:
: OD28o составит около 1,8.
8. Добавляют 0,1 объема ЗМ ацетата натрия и осаждают ДНК двумя объемами
холодного этанола при -20°С в те>-чение ночи, либо 30 мин при -70 °С.
276
Глава 4
9. Осаждают выпавшую ДНК центрифугированием в течение
3 мин в мини-центрифуге либо в течение 15 мин при 8000 об/мин в
центрифуге Sorval или аналогичной в силико-нированной пробирке из
корекса. Высушивают осадок под вакуумом и заново растворяют его в
стерильной дистиллированной воде, доводя до требуемой концентрации ДНК.
Препарат ДНК, хранящийся при -20°С, остается интактным в течение ряда
лет. ДНК можно хранить и в виде промытого спиртового осадка под 80%-ным
спиртом.
Примечания
1 М раствор CsCl/БЭ содержит 1 М CsCl в 50 мМ трис-HCl, pH 8,0,
10 мМ ЭДТА, 0,2 мг/мл БЭ (Sigma).
45 > 7 М раствор CsCl/БЭ содержит 7 М CsCl, 0,1% саркозила, 0,2 мг/мл БЭ.
Литература
1. Boulnois G. (1987) Principles of Gene Cloning and Analysis: A
Laboratory Guide. Blackwell Scientific Publication, Oxford.
2. Brawerman G. (1974) The isolation of messenger RNA from mammalian
cells. Methods in Enzymol. 30, 605-12.
3. Covey S. N., Hull R. (1981) Transcription of cauliflower mosaic
virus DNA: Detection of transcripts, properties and location of the gene
encoding the virus inclusion body. Virology 111, 463- 74.
4. Dellaporta S. L., Wood J., Hicks J. B. (1985) Maize DNA miniprep.
In: Molecular Biology of Plants: A Laboratory Course Manual, pp. 36-37.
Eds. Malmberg R., Messing J., Sussex 1. Cold Spring Harbor Press, New
York.
5. Hanson M. R., Boeshore M. L., McClean P. E., O'Connell M. A.,
NivisonH. T. (1986) The isolation of mitochondria and mitochondrial DNA.
Methods in Enzymol. 118, 437-53.
6. Lichtenstein C. P., Draper J. (1985) Genetic Engineering of
plants. In: DNA Cloning, Vol. II, pp. 67-119. Ed. Glover D. M. IRL Press,
Oxford.
7. Luthe D., Quatrano R. (1980) Transcription in isolated wheat
nuclei. II: Characterisation of RNA synthesised in vitro. Plant Physiol.
65, 309-13.
8. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J., eds (1982) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York.
9. Murray M. G., Thompson W. F. (1980) Rapid isolation of high
molecular weight plant DNA. Nucl. Acids Res. 8, 4321-5.
10. Palmer J. D. (1986) Isolation and structural analysis of chloroplast
DNA. Methods in Enzymol. 118, 167-86.
11. Pelham H. R. B-, Jackson R. J. (1976) An efficient mRNA-dependent
translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem. 67, 247-
56.
12. Richards G. M. (1974) Modifications of the diphenylamine reaction
giving increased sensitivity and simplicity in the estimation of DNA.
Anal. Biochem. 57, 369-76.
13. Takahashi H., Nitta T. (1986) Altered fractionation profiles of
higher plant poly (A)-containing RNA by selective formation of a complex
with a hydro-phobic impurty. Plant Science 43, 63-7.
14. Taylor J. M. (1979) The isolation of eukaryotic messenger RNA. Ann.
Rev. Biochem. 48, 681-717.
15. Walling L., Drews G. N.. Goldberg R. B. (1986) Transcriptional and
post-transcriptional regulation of soybean protein mRNA levels. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83, 2123-7.
16. Watson J. C., Thompson W. F. (1986) Purification and restriction
endonuclease analysis of plant nuclear DNA. Methods in Enzymol. 118, 57-
75.
Глава 5
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
Р. Скотт
5.1. Введение
Гибридизацию по Саузерну [7] используют для выявления и изучения
организации последовательностей ДНК после их разделения с помощью гель-
электрофореза. Процедура гибридизации подразделяется на два этапа. Первый
этап - перенос разделенных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану,
осуществляемый под действием капиллярных сил (в последнее время
применяется электроперенос) таким образом, чтобы относительное положение
каждой молекулы ДНК осталось неизменным. Второй этап - гибридизация
связанной ДНК с пробами, меченными изотопами (комплементарной ДНК), для
выявления определенных последовательностей ДНК- Анализ ДНК по Саузерну
включает в себя апуриниза-цию, денатурацию и нейтрализацию ДНК внутри
геля с последующим переносом и связыванием нуклеиновой кислоты с
мембраной. Далее мембрану инкубируют с одноцепочечной пробой, меченной
радиоактивным изотопом, а после отмывания - выявляют гибридизовавшиеся
гомологичные фрагменты ДНК путем авторадиографии с использованием
рентгеновской пленки.
В данную главу включено подробное описание обработки ДНК
