Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
тщательном перемешивании, в противном случае может выпасть осадок.
Выпадение осадка в реакционной смеси даже в случае соблюдения всех
предосторожностей, может свидетельствовать либо о том, что растворы
хлорной кислоты или дифениламина уже старые, либо о том, что хлорная
кислота недостаточно чистая. Кроме того, к образованию осадков могут
привести использование полистироловых емкостей для хранения растворов
дифениламина, перепад температуры, длительная экспозиция иа воздухе или
избыток полисахаридов в препарате нуклеиновых кислот.
" При одних и тех же температуре инкубации, времени, используя один и
тот же спектрофотометр, одну и ту же калибровочную кривую для каждой
реакции можно применять с достаточно высокой степенью точности, а не
строить каждый раз новый график.
*> Если OD6oo раствора ДНК превышает значение для контрольного раствора
ДНК с концентрацией 75 мкг/мл, то точные данные получить невозможно. В
таком случае следует разбавить раствор выделенной из растений ДНК и
повторить определение.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
265
4.7. Выделение тотальной РНК из растений
4.7.1. Общие положения
Для многих типов клеток методы выделения эукариотической мРНК сходны
[2, 14]. Ниже приведены две методики выделения тотальной РНК из растений.
В большинстве из них объем буфера для гомогенизации и масса клеточного
материала рассчитаны для листьев' широколиственных растений, каллусов
либо клеток суспензионной культуры. Методика, предусматривающая
использование фенола (разд. 4.7.3.1), подходит для выделения РНК из
листовых пластинок и культивируемых клеток более чем 20 видов растений.
При необходимости можно оптимизировать методики для других типов
растительного материала, например листьев злаков, плодов и т. д., чтобы
обеспечить эффективную экстракцию РНК и соответствующую обработку
экстракта.
Главное внимание при выделении РНК должно быть сосредоточено на
подавлении активности рибонуклеаз. При использовании любой из следующих
методик во избежание деградации РНК внутри- и внеклеточными ферментами
обычно принимают некоторые основные меры предосторожности:
- Стеклянную посуду прогревают в сушильном шкафу (150 °С,
3 ч), автоклавируют либо смачивают 0,5%-ным раствором
диэтилпирокарбоната и высушивают в течение 3 ч при 150°С. В случае
пластмассовой посуды используют лишь такие пробирки, которые можно
автоклавировать.
- По возможности все растворы, используемые для выделения РНК,
автоклавируют. На рабочем месте следует строго соблюдать чистоту, а чтобы
избежать загрязнения рибонуклеа-зами, присутствующими на коже,
исследователь должен надевать одноразовые резиновые перчатки.
- РНК следует хранить в присутствии детергента либо под этанолом при
низких температурах (от -20 до -80°С). По возможности следует
использовать вещества высокой степени очистки, например сахарозу,
свободную от РНКаз.
4.7.2. Фенольный метод выделения тотальной РНК из растений
4 7.2.1. Обеспечение
Примечание: все растворы для разрушения РНКаз следует обрабатывать, как
указано в разд. 4.7.1. Помимо этого стеклянную посуду необходимо
силиконироватъ.
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 II]).
- Большая ступка с пестиком.
266
Глава 4
- Окись алюминия (Sigma, тип 305).
- Жидкий азот.
- Центрифуга с охлаждением (например, Sorval RC-5B или аналогичная) с
угловым ротором 8X50 мл типа Sorvall SS34 (или эквивалентным).
- Полиалломерные центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками
(например, "Налджин", тип 3119, объем 38 мл).
- Пробирки из корекса объемом 30 мл (силиконированные и стерильные) и
резиновые прокладки.
- Конические колбы объемом 250 мл из пирекса.
- Силиконированные пастеровские пипетки.
- Защитные перчатки.
- Одноразовый респиратор.
- Защитная маска либо защитные очки.
Растворы
- Буфер для растирания (6%-ный 4-аминосалицилат; 1%-ный
триизопропилнафталинсульфонат (ТНС); 6%-ный фенол; 50 мМ трис-HCl, pH
8,4).
Раствор следует готовить заново непосредственно перед употреблением
следующим образом:
Готовят необходимые навески 4-аминосалицилата (Sigma) и ТНС
(Kodak).
Раствор фенола: уравновешивают фенол (BDH Analar или подвергнутый
перегонке), содержащий 0,1% 8-гидроксихино-лина, раствором 100 мМ трис-
НС1, pH 7,5, и хранят не более 8 нед в темноте при 4°С.
1 М трис-HCl, pH 8,4.
- Смесь фенол/хлороформ (50,0% фенола, 48,0% хлороформа, 2% изоамилового
спирта, 0,1% 8-гидроксихинолина).
Раствор следует готовить заново непосредственно перед употреблением
следующим образом:
Смесь фенол/гидроксихинолин готовят так же, как и в случае буфера для
растирания (см. выше).
Готовят смесь хлороформ/изоамиловый слирт (24:1), на нее следует
наслоить 100 мМ трис-HCl (pH 7,4) для предотвращения испарения. Раствор
можно хранить под тягой в течение нескольких месяцев.
