Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
растворяется не весь материал. Если изначально осадок образует суспензию
прозрачных частиц, то весьма вероятно, что он состоит главным образом из
РНК. Осадок следует оставить на льду примерно на один час, время от
¦времени перемешивая суспензию РНК силиконированной пастеровской
пипеткой. Если взвешенные частицы непрозрачны, то возможно, что препарат
РНК сильно загрязнен полисахаридами. В таком случае следует растворить
как можно большую часть осадка, отцентрифугировать нерастворимые примеси
при 5000 об/мин в течение 5 мин и отбросить.
*> Избыток полисахаридов в экстракте не всегда удаляется смесью фенол/
хлороформ и может загрязнять препараты РНК на всех стадиях очистки,
затрудняя ее растворение н делая невозможными спектрофотометрические
измерения. Кроме того, примеси полисахаридов забивают колонки с ¦олиго-
(с1Т)-целлюлозой, а также препятствуют трансляции и синтезу кДНК in vitro
[13]. Содержание углеводов в растительном материале можно контролировать
путем выращивания при низкой интенсивности освещения, либо подбирая такой
режим питания растений, который способствует •быстрому вегетативному
росту, а не запасанию усвоенного углерода. Собирая материал (суспензию
клеток, каллус, размножающиеся растения) яа стадии быстрого роста, можно
свести к минимуму проблемы, возникающие при избытке углеводов.
В некоторых случаях для полного удаления полисахаридов из экстрактов
нуклеиновых кислот используют разнообразные методики. Наиболее
распространенные нз них основаны на центрифугировании РНК через слой
¦CsCl. Под раствор РНК можно подслоить 1/3 объема 5,7 М CsCl и затем
центрифугировать в бакет-роторе в течение 16 ч при 25 000 об/мин и 20 °С.
Тяжелая РНК образует рыхлый осадок на дне пробирки, а легкие примеси не
проходят через ннтерфазу.
ДНК растворима в 3 М ацетате натрия и остается в супернатанте.
¦"^Необходимо отметить, что растворы РНК следует замораживать очень
.быстро, погружая пробирки с открытыми крышками в жидкий азот. Затем в
крышках проделывают небольшое отверстие, чтобы при вынимании из жидкого
азота предотвратить расширение газа, которое может привести к выбиванию
крышек.
4.7.3. Метод выделения тотальной РНК из растений при помощи хлористого
лития
4.7.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы Те же, что и в разд. 4.7.2.1.
1 Согласно правилам техники безопасности, растворы, содержащие
фенол, •ни в коем случае нельзя смывать с кожи спиртом. Для этого следует
использовать раствор аммиака или соды (примерно 1 н. или 2%). - Прим.
ред. пер.
270
Глава 4
Растворы
Те же, что и в разд. 4.7.2.1 и кроме того:
- 8 М хлористый литий (BDH Analar) (340,2 г/л).
- 70%-ный этанол.
4.7.3.2. Методика
1. Собирают растительную ткань, помещают ее в жидкий азот и либо хранят
при -80 °С, либо сразу же используют.
2. Растирают ткань пестиком в ступке (пестик и ступка должны быть
предварительно охлаждены жидким азотом) с небольшим количеством окиси
алюминия под жидким азотом. Смешивают получившийся мелкий порошок с
буфером для растирания (используют 2 мл/г ткани) и переносят в стерильную
центрифужную пробирку объемом 50 мл (из пирекса или полипропилена).
Осторожно покачивают в тече* ние нескольких минут с равным объемом смеси
фенол/хлороформ.
3. Центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин в роторе Sorval GSA
(или аналогичном).
4. Переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку и трижды повторяют
экстракцию смесью фенол/хлороформ.
5. Осаждают экстрагированные нуклеиновые кислоты, добавив ацетат натрия
до концентрации 0,2 М и 2,5 объема этанола. Оставляют на ночь при -20 °С.
6. Центрифугируют в течение 10 мин при 8000 об/мин, промывают осадок,
ресуспендируют его в 70%-ном спирте, снова центрифугируют и затем
высушивают осадок.
7. Растворяют осадок в минимальном объеме стерильной воды и добавляют
половину объема 8,0 М хлористого лития. На 30 мин помещают пробирку на
лед, а затем центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Вся
ДНК должна остаться в растворе. Перед тем как растворить РНК в
соответствующем количестве стерильной дистиллированной воды, осадок
следует дважды промыть 70%-ным этанолом.
8. Отбирают аликвоту препарата РНК и снимают его спектр, чтобы оценить
количество и качество РНК. Затем доводят до нужной концентрации и хранят,
как на стадиях 8 и 9 разд. 4.7.2.2.
4.8. Выделение ро1у(А)+-мРНК
4.8.1. Общие положения
Эукариотическую информационную РНК (мРНК) можно
отделить от других типов РНК в тотальных препаратах путем
аффинной хроматографии благодаря наличию полиаденилового
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
271
ч<хвоста" длиной от 20 до 250 н. на З'-конце молекулы. Обычно шспользуют
имеющуюся в продаже oligo(dT)-целлюлозу или ро1у(11)-сефарозу. Они
состоят из полимеров длиной 10-20 н. (Т либо U), и при высоких
концентрациях соли гибридизуются -с ро1у(А)+-РНК и связывают ее. При этом
длина хвоста должна составлять по крайней мере 15-20 н. Рибосомная РНК и
