Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
добавлять постепенно. ж> Лизаты хлоропластов перед нанесением на градиент
CsCl/БЭ часто необходимо освободить от крахмала и остатков клеточных
стенок центрифугированием в бакет-роторе при низких скоростях.
4.6. Определение концентрации ДНК в неочищенных препаратах нуклеиновых
кислот с помощью дифениламина
4.6.1. Общие положения
Дифениламин [12] можно использовать для цветной реакции с ДНК 'В
неочищенных экстрактах из тканей растений и ее количественного
определения посредством спектрофотометрии. Поглощение при 600 нм (СШбоо)
при этой реакции более или менее прямо пропорционально содержанию ДНК в
растворе при ее концентрациях от 0 до 100 мкг/мл. В этих пределах
строится калибровочная кривая зависимости OD6oo от концентрации для
чистой ДНК. Концентрацию ДНК в пробах, выделенных из растений, затем
определяют с помощью этой калибровочной кривой. В связи с тем -что
концентрация выделенной из растительных тканей ДНК будет различной,
целесообразно использовать несколько разведений исходного препарата,
чтобы получить значения OD6oo, попадающие на линейный участок
калибровочной кривой.
Специфичность реакции на ДНК подразумевает, что такой способ
определения в отличие от измерения оптического поглощения неочищенного
экстракта нуклеиновых кислот при 260 нм, легко позволяет отличить РНК и
ДНК и гораздо более точен. Таким образом, различие в содержании
нуклеиновых кислот, определенное с помощью дифениламина, и измерения
OD26o позволяют установить содержание примеси РНК в препарате.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
263
4.6.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 111]).
- Вытяжной шкаф.
- Термостат на 30 °С, позволяющий инкубировать материал без воздействия
света.
- Пластмассовые кюветы (объемом 0,5 мл) с длиной светового пути 1 см
(Sarstedt).
- Спектрофотометр, установленный на длину волны 600 нм.
- Стеклянный стакан для слива отходов.
- Бумага для графиков.
Растворы
- Зн. раствор хлорной кислоты: 49,2 мл хлорной кислоты (BDH Analar)
доводят до 200 мл дистиллированной водой. Раствор перемешивают и хранят в
кислотнице под тягой. Обращаться с ним следует осторожно, поскольку 3 н.
хлорная кислота весьма едкая. Раствор стабилен в течение нескольких
месяцев при комнатной температуре.
- Раствор дифениламина: готовят 4%-ный раствор дифениламина (BDH
Analar) с 0,01 % паральдегидом в ледяной уксусной кислоте (BDH Analar)
следующим образом.
Примечание: все используемые вещества ядовиты, в особенности
дифениламин, и, следовательно, при работе с большими количествами все
процедуры следует проводить под тягой. Добавляют 20 мкл паральдегида (BDH
Analar) к 198 мл ледяной уксусной кислоты (BDH Analar) в колбе
Эрленмейера из пирекса объемом 250 мл.
Осторожно взвешивают 8 г дифениламина (BDH Analar), надев перчатки и
респиратор. Добавляют дифениламин к смеси паральдегида с ледяной уксусной
кислотой и сразу же прикрывают фольгой, чтобы избежать воздействия света.
Перемешивают до полного растворения всего дифениламина. Хранят в
кислотнице из пирекса при комнатной температуре в защищенном от света
вытяжном шкафу. Если раствор дифениламина начал краснеть, то он не
годится для использования. Как правило, при хранении в темноте раствор
можно использовать в течение месяца.
- Стерильная дистиллированная вода.
- Стандартные растворы ДНК спермы сельди (Sigma) с концентрацией от 5
до 100 мкг/мл.
264
Глава 4
4.6.3. Методика
1. Работая под тягой, добавляют реагенты в пробирки Эппендорф,
содержащие препараты ДНК из растений или стандартные растворы в следующем
порядке:а)
10 мкл раствора ДНК или дистиллированной воды для раствора с нулевой
концентрацией 140 мкл дистиллированной воды 150 мкл 3 н. хлорной кислоты
180 мкл раствора дифениламина.
2. Закрывают пробирки, перемешивают растворы, переворачивая пробирки, и
инкубируют в темноте 16-20 ч (в течение ночи) при 30 °С. Важно всегда
проводить инкубацию в течение одного и того же промежутка времени при
одной и той же температуре, "наче каждый раз придется заново строить
калибровочную кривую6).
3. Устанавливают на спектрофотометре длину волны 600 нм и затем выводят
показания на нуль с помощью контроля, содержащего дистиллированную воду
вместо раствора ДНК. Измеряют OD6oo для стандартных растворов ДНК и
строят калибровочную кривую зависимости OD6oo от концентрации ДНК.
4. Определяют по калибровочной кривой концентрацию ДНК для каждого
образца. Между концентрацией ДНК в диапазоне 5-75 мкг/мл и ООбоо имеется
строгая линейная зависимость1^.
5. Доводят концентрацию выделенной из растений ДНК до 0,25-
1,0 мкг/мкл, разводя образцы стерильной дистиллированной водой. Если
пробы слишком разбавлены, необходимо сконцентрировать их, осаждая ДНК
этанолом и добавляя определенное количествво воды.
Примечания
*) Реагенты следует добавлять осторожно в указанном порядке при
