Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
- 4 М ацетат натрия, pH 6,0 (pH доводят ледяной уксусной кислотой, BDH
Analar). ¦
- Этанол (абсолютный).
- Стерильная НгО. Фильтруют через миллипоровый фильтр и автоклавируют.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
267
4.7,2.2. Методика
Примечание: на всех стадиях, кроме указанных, следует держать
экстракты РНК на льду и охлаждать всю посуду.
1. Быстро готовят необходимые навески овежего растительного материала
(очищенного от земли, агара или избытка воды) ¦массой 1-5 г и как можно
быстрее замораживают после нарезания в жидком азоте. До использования
хранят в жидком азотеа>. Для выделения РНК следует по возможности
использовать лишь молодую ткань интактных растений либо быстрорастущие
культуры клеток.
2. Добавляют 0,5 г окиси алюминия к соответствующему количеству
замороженного исходного материала (3 г культуры клеток или 10 г листьев)
в предварительно охлажденной ступке и растирают предварительно
охлажденным пестиком в мелкий порошокб>.
3. Добавляя по каплям (2 мл/г ткани) буфер для растирания, продолжают
измельчение. Время от времени, чтобы ткань не оттаивала, добавляют жидкий
азот. Тщательно растирают ткань и переносят ее в замороженном состоянии в
колбу объемом 250 мл.
4. Добавляют равный объем смеси фенол/хлороформ и дают смеси оттаять на
льду. Надев защитные очки, периодически встряхивают колбув>, чтобы
измельченная в порошок ткань равномерно распределилась по всему объему.
Когда гомогенат оттает, переносят его в две полиалломерные пробирки
объемом
38 мл и перемешивают, переворачивая их. Разделяют фазы
центрифугированием в угловом роторе при 5000 об/мин в течение 10 мин и
4°С.
5. Стараясь не захватить выпавший в осадок белок интерфазы, переносят
силиконированной пастеровской пипеткой водную фазу в новые пробирки и
трижды повторяют экстракцию смесью фенол/хлороформ.
6. Переносят аликвоты водной фазы объемом 7 мл в четыре пробирки из
корекса объемом 30 мл, добавляют 4 М ацетат натрия (pH 6,0) до конечной
концентрации 0,2 М и тщательно перемешивают. Добавляют 2,5 объема
холодного (-20 °С) этанола, перемешивают, переворачивая пробирки, и
собирают общий осадок нуклеиновых кислот центрифугированием (10 000
об/мин, 4°С, 10 мин). Осадок должен быть белым; если он окрашен, то для
удаления примесей следует несколько раз переосадить его спиртом.
Осторожно сливают супернатант и тщательно растворяют осадок в минимальном
объеме стерильной дистиллированной воды (не более 0,5 мл/г ткани) г>' д).
268
Глава 4
7. Добавляют 4 М ацетат натрия до конечной концентрации
3,0 М, тщательно перемешивают, помещают на 2-3 ч на лед и
центрифугируют при 10 000 об/мин при 4°С 10 мин, чтобы отделить РНК от
ДНКе)- Если осадок не образуется, центрифугируют еще 20 мин. Заново
растворяют осадок РНК в минимальном объеме (200-1000 мкл) 0,2 М ацетата
натрия ь осаждают спиртом (см. стадию 6).
Длина волны, нм
Рис. 4.1. Поглощение в ультрафио-лете (200-300 нм)
чистого препарата тотальной РНК.
рат на аликвоты по 0,5 мл i винчивающимися крышками
8. Высушивают в эксикаторе осадок РНК и растворяют его з минимальном
объеме (100 мкл) дистиллированной Н20. Разводят аликвоту тотального
препарата РНК и определяют концентрацию РНК на сканирующем
спектрофотометре, измеряя OD между 200 и 300 нм (1,00 OD26o = 37 мкг/мл).
По спектру образца можно судить
о чистоте препарата. Чистые препараты РНК имеют соотношение ODseo:
OD28o около 2,0 и OD23o : OD26o менее чем 0,5. Типичная кривая поглощения
чистого препарата РНК представлена на рис. 4.1. Необходимо отметить явно
выраженный острый пик при 260 нм и отсутствие на кривой "плеч".
9. Разводят раствор РНК водой до концентрации 5 мг/мл и хранят в
замороженном состоянии -70 °С или в жидком азотеж), если требуется более
длительное хранение, разлив препа-
I полипропиленовые пробирки с за-
или пробирки Эппендорф.
Примечания
а> Важно не смять материал и не дать ему увянуть, поскольку это влияет на
эффективность экстракции и качество препаратов РНК. Повреждение многих
типов растительных тканей приводит к быстрому синтезу полифе-иолов
(коричневое окрашивание), которые трудно отделить от нуклеиновых кислот.
Образование полифенолов можно свести к минимуму осторожным нарезанием и
быстрым замораживанием тканей. Кроме того, необходимо иметь в виду, что в
результате поранения очень быстро образуются транскрипты, индуцированные
стрессом.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
269
*> При растирании ткани необходимо соблюдать меры предосторожности.
Следует надеть респиратор и защитные очки, чтобы предотвратить вдыхание
окиси алюминия и уберечь лицо.
¦*> Необходимо встряхивать колбу осторожно, поскольку фенол ядовит, а ТНС
- очень едкое вещество. Если даже капля буфера для растирания попадает на
кожу, следует промыть поврежденное место смесью этанол/ ПЭГ 300 (70 : 30)
или глицерином1.
1Г) Очень важно, чтобы осадок полностью растворился, однако часто
