Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
100 мл буфера для нанесения.
г> Этот объем зависит от объема микрокюветы, используемой для измерения.
Приложение 4 [I]
Выделение больших количеств тотальной ДНК из клеток
растений с помощью СТАВ
1. Смешивают 1 г лиофилизированной растительной ткани с-
4 г окиси алюминия (Sigma, тип 305) и растирают в ступке' пестиком в
очень мелкий порошок. Для разрушения растительной клеточной стенки это,
очевидно, самая важная стадия, которая определяет хороший выход ДНК.
2. Переносят порошок в полипропиленовую центрифужную-пробирку объемом
50 мл (например, "Налджин", 3100-0500 или эквивалентную), добавляют 15 мл
однократного СТАВ-буфера для экстракции (разд. 4.2.2.1) и осторожно
перемешивают одноразовой пластмассовой палочкой (Sarstedt) до гомогенного
состояния.
3. Закрывают пробирку и инкубируют в течение 20 мин на водяной бане
при 56 °С, время от времени осторожно поворачивая пробирку, чтобы
экстракт не расслаивался.
274
Глава 4
4. Охлаждают инкубационную смесь До комнатной температуры. Однако
температура не должна опускаться ниже 15°С, иначе СТАВ выпадет в осадок.
5. Добавляют 15 мл смеси хлороформ/октанол (24:1, объем на объем),
закрывают пробирку, и, осторожно переворачивая ее, перемешивают
содержимое до образования однофазной эмульсии.
6. Осаждают клеточный дебрис и разделяют органическую и водную фазы
путем центрифугирования при 8000 g (т. е. при 10 000 об/мин в роторе
Sorval SS34 объемом 8x50 мл) в течение 10 мин при 20°С.
7. Переносят водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку объемом 50
мл. Стараются не захватывать денатурировавший белок интерфазы.
8. Добавляют 0,1 объема (1,5 мл) 10%-ного СТАВ (разд. 4.2.2.1).
Осторожно перемешивают и повторяют экстракцию смесью хлороформ/октанол.
9. Стараясь не захватить дебрис, переносят водную фазу в подходящую
стерильную стеклянную центрифужную пробирку (например, пробирку из
корекса либо пирекса). Подходят центрифужные пробирки из пирекса для
низкоскоростного центрифугирования объемом 16X125 мм (Corning).
10. Добавляют равный объем однократного СТАВ-буфера для осаждения (разд.
4.2.2.1), осторожно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на
30 мин для формирования осадка. При необходимости образцы можно оставить
и на более длительное время.
11. Центрифугируют осадок при 1500^ в течение 10-15 мин при комнатной
температуре. Очень важно, чтобы образование осадка происходило не слишком
интенсивно, поскольку более плотный осадок труднее растворить. В хороших
препаратах осадок должен быть белым, либо слегка окрашенным.
12. Подсушивают осадок, перевернув пробирку в штативе на фильтровальную
бумагу. На этой стадии в случае необходимости осадок можно оставить на
ночь при 4°С или нанести на градиент CsCl/БЭ в соответствии с методикой,
представленной в приложении 4[И].
Приложение 4 [II]
Очистка ДНК из растений в градиентах CsCl/БЭ
Необходимо отметить, что объемы растворов, приведенные
в данной методике, можно изменять, если соответственно использовать
меньшие количества растворов нуклеиновых кислот, что зависит от объема
центрифужной пробирки. Методика
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
275"
может быть оптимизирована для неочищенных препаратов* ДНК, полученных
самыми разнообразными способами, а не только с помощью СТАВ. Самое важное
- это точно соблюдать плотность CsCl и не перегружать градиент
нуклеиновой: кислотой.
1. Растворяют осадок, полученный на стадии 12 приложения: 4[1], в 2,4 мл
1 М раствора CsCl/БЭ3), нагревая его до 56 °С на водяной бане. Бромистый
этидий позволяет увидеть-любой осадок нуклеиновых кислот на стенках
центрифужной пробирки. Следует отметить, что, хотя при добавлении
1 М раствора CsCl/БЭ большая часть непрозрачного СТАВ-в осадке
растворяется быстро, для растворения нуклеиновых кислот требуется более
длительное время.
2. Переносят растворившиеся нуклеиновые кислоты в центрифужную пробирку
от ротора Beckman VTi 65 либо аналогичную. Добавляют 2,9 мл 7 М раствора
CsCl/БЭ6), закрывают пробирки и перемешивают их содержимое, осторожна-
переворачивая.
Кроме того, можно довести плотность растворов ДНК в; 30 мМ трис-НС1,
pH 8,0, 10 мМ ЭДТА, до 1,55 г/мл, прибавляя CsCl, и затем добавить БЭ
(Sigma) до 0,2 мг/мл.
3. Центрифугируют при 58 000 об/мин в течение 4 ч либо при: 40 000 об/мин
в течение ночи (16 ч) в роторе VTi 65. Если не использовать вертикальный
ротор, то .может потребоваться более длительное время.
4. Визуализируют ДНК при освещении длинноволновым
(320 нм) ультрафиолетом и отбирают зону, проколов пробирку шприцем на
1 мл, снабженном- иглой № 19. РНК. осаждается на стейку пробирки, и
следует соблюдать осторожность, чтобы не захватить ее.
5. Удаляют бромистый этидий пятикратной экстракцией раствора
изопропанолом, насыщенным раствором CsCl. Бромистый этидий переходит в
органическую фазу, которую можно' отбросить.
6. Удаляют CsCl диализом против 2 л дистиллированной водьг при 4°С, меняя
