Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 117

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 111 112 113 114 115 116 < 117 > 118 119 120 121 122 123 .. 184 >> Следующая

мМ, и затем собирают хлоропласты и митохондрии центрифугированием
соответственно при 2000 к 10 000 g в течение 15 мин при 4°С.
6. В разных пробирках ресуспендируют осадки (используя при необходимости
гомогенизатор Поттера или кисточку) в буфере для выделения органелл (30
мл для хлоропластов и 8 мл для митохондрий) путем центрифугирования в
ступенчатом градиенте сахарозы.
Хлоропласты [10]
а) Готовят четыре ступенчатых градиента в центрифужных пробирках для
бакет-ротора (например, SW27). При этом на 18 мл 52%-ной сахарозы в 50 мМ
трис-НС1, pH 8,0, и 25 мМ ЭДТА наслаивают 7 мл 30%-ной сахарозы в том же
буферег).
б) Осторожно наслаивают 7,5 мл суспензии хлоропластов на каждый
градиент. Убеждаются, что пробирки уравновешены я затем центрифугируют
при 25 000 об/мин (30 мин, 4°С) в роторе SW27 (либо аналогичном).
в) Отбирают зону хлоропластов, находящуюся между слоями 52- и 30%-ного
градиента, с помощью пластмассовой одноразовой пипетки с широким носиком.
При этом стараются захватить как можно меньший объем и помещают суспензию
на лед в силиконированном стакане из пирекса.
Митохондрии [5]
а) Готовят два ступенчатых градиента сахарозы в центрифужных пробирках
для бакет-ротора. При этом каждый градиент
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
261
состоит из трех слоев охлажденной до 4°С 1,6, 1,2 и 0,6 М сахарозы в
50 мМ трис-НС1 (pH 8,0), 20 мМ ЭДТА и 0,1% БСА. Объем каждого слоя - 8
мл. Часто проще всего сначала приготовить раствор 0,6 М сахарозы и затем
последовательно подслаивать под него более концентрированные растворы.
б) Осторожно наслаивают суспензию митохондрий на каждый градиент и
центрифугируют в течение 1 ч при 25 000 об/мин и 4 °С.
в) Нижняя зона, на границе 1,6 и 1,2 М сахарозы, окрашенная в кремовый
цвет, содержит большую часть интактных митохондрий. Эту зону следует
отобрать пипеткой или шприцем, стараясь захватить как можно меньший
объем, и поместить в силиконированный стакан из пирекса объемом 250 мл.
7. В течение нескольких минут постепенно разводят (чтобы избежать
осмотического шока) фракцию органелл тремя объемами охлажденного до 4°С
буфера для выделения органелл. Переносят препараты хлоропластов и
митохондрий в разные пробирки объемом 38 мл и осаждают органеллы
соответственно при 2000 и 10 000 g в течение 15 мин при 4°С.
8. Промывают осадок органелл, ресуспендируя и осаждая его в 25 мл буфера
для промывания.
9. Вновь суспендируют каждый осадок в 5 мл буфера для лизиса-5) и затем
на льду, постоянно покачивая, по каплям добавляют 20%-ный раствор
саркозила до конечной концентрации 1%е>.
10. Из лизированных органелл ДНК можно выделить в градиенте плотности
CsCl/БЭ, как описано в приложении 4[И]Ж>. Другие методики выделения ДНК
из очищенных органелл некоторых видов растений описаны в литературе [5,
10].
Примечания
а> Перед выделением хлоропластов целесообразно выдерживать растения (1-4
дня) в темноте для снижения содержания крахмала. Хэнсон с сотрудниками
[5] в качестве удобного источника для выделения митохондрий рекомендует
использовать клетки суспензионной культуры.
6) Размельчение определенных типов волокнистых тканей (например, листьев
злаков) в гомогенизаторе Уоринга часто приводит к выжиманию сока без
разрушения многих клеток. Волокнистый материал из таких экстрактов можно
удалить фильтрованием через марлю, а оставшиеся интакт-ными клетками
гомогенизировать в гомогенизаторе "Политрон".
Е) Обработка загрязненных осадков органелл ДНКазой I несомненно
способствует более полной очистке хлоропластной и митохондриальной ДНК от
примесей ядерной ДНК и позволяет получать препараты с большей мол.
массой. Однако процедуру обработки ДНКазой I можно и опустить, если есть
подозрения, что на этой стадии происходят значительные потери материала.
262
Глава 4
*> Важно не перегрузить градиент (-в особенности это касается выделения
хлоропластов) во избежание слишком плотного скопления органелл в
интерфазе, что может способствовать соосаждению ядериой ДНК- Оптимальное
соотношение между числом необходимых пробирок с градиентами и количеством
гомогенизируемой ткани составляет примерно 20-30 г свежей ткани на
градиент, что определено эмпирически для многих видов растений. Чтобы
предотвратить перегрузку градиента хлоропластами, Палмер с сотрудниками
[10] предлагает интенсивно смешивать 30%-иуЮ сахарозу верхнего слоя с
52%-ной сахарозой нижнего слоя, при этом иитер-фаза оказывается
диффузной. Можно приготовить градиент и за несколько дней до
использования, чтобы между двумя слоями произошла диффузия и был бы
достигнут тот же эффект. д> Выход и чистота ДНК могут быть улучшены, если
перед добавлением детергента в буфер для лизиса обработать органеллы в
течение 2 мин при комнатной температуре (либо 15 мин на льду)
предварительно прогретой (2 ч при 37 °С) проназой в концентрации 1мг/мл.
*' Для более полного лизиса важно, чтобы органеллы перед добавлением
раствора детергента были тщательно ресуспендированы. Детергент следует
Предыдущая << 1 .. 111 112 113 114 115 116 < 117 > 118 119 120 121 122 123 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed